使用快速色谱方法对反义寡核苷酸纯化组分进行在线分析

《Journal of Chromatography A》：At-Line Analysis of Antisense Oligonucleotide Purified Fractions Using Fast Chromatographic Methods

本研究开发并实现了用于多柱逆流溶剂梯度纯化（MCSGP）的快速离子对液相色谱-紫外（LC-UV）在线分析方法，解决了传统40分钟LC-UV-MS方法耗时长、依赖人工采样的问题，将检测时间缩短至6.5分钟，支持实时工艺决策，提升ASO生产效率和纯度控制精度。

　　在当前的抗病毒寡核苷酸（ASO）制造过程中，快速的分析方法对于提高工艺控制效率和确保产品质量至关重要。然而，现有的ASO分析技术往往耗时较长，这在制造流程中形成了明显的瓶颈。为了解决这一问题，本研究开发并实施了一种快速的色谱分析方法，用于在线监测ASO纯化后的分馏，重点在于与多柱逆流溶剂梯度纯化（MCSGP）技术的集成。该方法采用了一种6.5分钟的离子对液相色谱（IP-LC）技术，结合紫外（UV）和质谱（MS）检测手段，能够在短时间内完成对ASO样品的分析。通过对注射体积（2-4 μL）和样品浓度（0.1-0.2 mg/mL）等方法参数的优化，该方法在速度、灵敏度和色谱性能之间达到了良好的平衡。该方法在不同类型的ASO样品中表现出与验证过的40分钟LC-UV-MS方法相当的性能，包括连接的粗制和纯化材料。快速方法在检测限和定量限方面优于传统方法，同时保持了良好的线性（R2 > 0.99）和稳健性，特别是在高盐分的MCSGP样品中（高达60 mM NaCl）。对于主要成分的准确性，例如紫外纯度、质谱纯度、完整长度百分比（% full length-n）以及重复性（%RSD < 2%），在不同样品类型中均得到了较好的验证。该方法的快速性和对在线和潜在在线分析的兼容性，代表了ASO制造过程控制的重要进展。

ASO是一种短的合成核苷酸链，其设计目的是通过沃森-克里克碱基配对机制特异性地结合到目标mRNA上。这种结合能够通过多种机制调控基因表达，例如通过RNase H介导的mRNA降解或通过阻碍翻译过程。近年来，ASO疗法在多种疾病的治疗中展现出巨大的潜力，特别是那些具有遗传基础的疾病，包括罕见遗传病、肿瘤学和神经退行性疾病。根据一项关于商业寡核苷酸药物产品的最新综述，美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）已批准了20种寡核苷酸药物用于治疗各种人类疾病。随着对ASO疗法的关注度增加，相关合成和纯化技术也得到了快速发展，这些技术是生产具有特定序列和高纯度的寡核苷酸的关键步骤。ASO的合成通常采用固相磷酸胺化学方法，这种方法自Matteucci和Caruthers引入以来，一直是寡核苷酸制造的标准方法。固相合成能够精确地构建序列，从而得到完整的寡核苷酸（FLP），但同时也可能产生多种杂质，包括截断序列、帽化序列和其他副产物。因此，纯化过程对于确保最终产品的质量和安全性至关重要。

许多寡核苷酸药物采用批次阴离子交换色谱（AEX）进行纯化。由于完整的寡核苷酸（FLP）逐渐从杂质中分离出来，通常会观察到一个宽广的紫外（UV）峰。这些宽广的UV峰会被分别收集为分馏，例如每隔半到两个柱体积进行收集，分馏的总数因工艺而异，但通常在7到40个之间。为了识别符合质量要求的分馏区域，需要从分馏中取少量样品并混合，形成多个模拟池。通常在质量控制（QC）实验室中测试7到10个模拟池，以评估杂质分布并确定其是否适合后续的药物物质处理。这一过程控制分析使用了一种经过验证的离子对液相色谱-紫外-质谱（IP-LC-UV-MS）方法，结合了紫外检测和质谱检测，广泛用于复杂寡核苷酸的分析。然而，当前的批次色谱过程包括手动样品稀释、脱盐和数据分析，已成为纯化过程中的瓶颈，不仅耗时至少三天才能完成cGMP生产，还需要冷藏存储分馏，这种做法在实际操作中难以持续。

在制造过程中，使用在线LC-UV方法可以在收集分馏的同时提供有关其纯度的信息。这种方法能够根据每个分馏的数据做出关于模拟池的选择决策，而不是依赖于从预分离色谱系统中获取的宽广UV峰，然后等待QC实验室的结果。在这种情况下，只需分析非常有限数量的模拟池，甚至可能只需要一个。此外，在线技术能够确保纯化过程的有效运行，并在分馏收集时实时提供符合要求的信息，而不是等到QC结果出来后再进行调整。未来，可以进一步引入在线技术，使样品在适当的时间间隔内自动从生产过程中取出，并进行分析，从而实现更加自动化和高效的监控。

当前的批次色谱纯化效率约为60-80%，这在制造过程中构成了明显的瓶颈。为了解决这一问题，评估了多柱逆流溶剂梯度纯化（MCSGP）技术的潜力，以提高纯化效率。MCSGP能够在每小时或根据工艺参数调整的时间间隔内生成一个产品窗口（PW），即一个被收集为纯化的区域。为了提高纯化效率，低质量的分馏会被自动回收，从而进行进一步的分离循环，减少整体材料的损失。在大规模生产中，能够及时测量纯度的工艺分析技术（PAT）对于连续运行MCSGP几天至关重要。尽管在生物制造过程中，已经将在线或近线PAT技术作为标准应用，但在寡核苷酸制造中的应用仍较为有限。虽然中红外（mid-IR）和拉曼（Raman）光谱技术已经开始在监控和优化ASO固相合成过程中发挥作用，但目前还没有具体报告关于在纯化过程中使用快速的离子对液相色谱和紫外-质谱的在线方法。

本研究中开发的方法是目前所知的第一种在MCSGP纯化过程中直接实施在线LC分析的手段，适用于工艺开发、优化以及制造阶段。该方法被定制用于近实时监测ASO纯化分馏，从而实现对模拟池选择和工艺控制的即时决策。该方法的引入填补了寡核苷酸制造过程中的关键空白，提供了高通量的分析能力，同时具备足够的分辨率来支持纯化流程。此外，该方法能够在短时间内完成分析，避免了传统方法所需的时间，从而显著提高了生产效率。通过这种快速且可靠的分析手段，可以更高效地进行工艺优化，减少对QC实验室的依赖，提高整个制造流程的透明度和可控性。

在材料和试剂方面，本研究使用了多种高纯度的化学试剂，包括LC/MS级别的乙腈（Fisher Chemical，Cat# A955-4，Lot# 222883）、三乙胺（Sigma Aldrich，Cat# 90781-50ML，Lot# 102615672）、冰醋酸（J.T. Baker，Cat# 9508-05，Lot# 0000252049）、乙二胺四乙酸（EDTA；Sigma Aldrich，Cat# 431788-25G，Lot# 1003503541）、氯化钠（Merck，Cat# 1370179012，Lot# K50082917 815）、10N氢氧化钠溶液（Fisher Chemical，Cat# SS255-4，Lot# 221402）以及超纯水（18.2 MΩ·cm，Milli-Q Plus或等效产品）。这些试剂的选择和使用是为了确保分析过程的准确性和可靠性。

在初步开发阶段，为了将传统的高效液相色谱（HPLC）方法转换为超高效液相色谱（UPLC）方法，并进行测试，本研究利用了ACQUITY UPLC Columns Calculator工具。虽然保留了固定相和流动相，但将HPLC方法转换为UPLC方法需要减少柱长（从150 mm到50 mm）和颗粒大小（从3.5 μm到1.7 μm），这些都是在更短的运行时间和更高的流速下实现高效分离的关键因素。这种转换使得在保持分离效果的同时，显著缩短了分析时间，提高了工作效率。

在实验过程中，需要对各种参数进行调整和优化，以确保方法的稳定性和可靠性。例如，注射体积和样品浓度的选择对检测的灵敏度和分辨率有直接影响。通过多次实验和验证，确定了最佳的注射体积（2-4 μL）和样品浓度（0.1-0.2 mg/mL），使得在保持高分辨率的同时，提高了检测的效率。此外，对于不同类型的样品，如连接的粗制材料和纯化材料，进行了广泛的测试，以确保方法在不同情况下的适用性。这些测试不仅验证了方法的准确性，还确保了其在不同样品类型中的稳健性。

在测试过程中，采用了多种检测手段，包括紫外检测和质谱检测。紫外检测能够快速识别样品中的主要成分，而质谱检测则能够提供更详细的分子信息。通过结合这两种检测手段，能够更全面地评估ASO样品的质量和纯度。同时，该方法在高盐分的MCSGP样品中表现出良好的性能，这在实际生产过程中尤为重要，因为高盐分环境可能会影响分离效果。因此，该方法不仅适用于常规的分析需求，还能够在复杂的生产条件下保持良好的稳定性。

在实际应用中，该方法的快速性和准确性使得其在工艺开发和优化过程中具有重要价值。通过在MCSGP纯化过程中实施在线LC分析，能够实时监测分馏的纯度，从而做出更及时的工艺调整。这种实时监控不仅提高了生产效率，还减少了对QC实验室的依赖，使得整个制造过程更加高效和可控。此外，该方法的高分辨率和良好的线性（R2 > 0.99）使得其能够准确地识别和区分不同的杂质，从而确保最终产品的高质量。

在测试过程中，还需要对数据进行处理和分析，以确保结果的准确性和可靠性。传统的数据处理方法往往较为复杂，需要大量的时间和人力投入。而该方法通过优化数据处理流程，使得分析更加高效和自动化。同时，对于不同类型的样品，如完整长度的ASO和含有杂质的样品，进行了广泛的测试，以确保方法在不同情况下的适用性。这些测试不仅验证了方法的准确性，还确保了其在不同样品类型中的稳健性。

在实际应用中，该方法的快速性和准确性使得其在工艺开发和优化过程中具有重要价值。通过在MCSGP纯化过程中实施在线LC分析，能够实时监测分馏的纯度，从而做出更及时的工艺调整。这种实时监控不仅提高了生产效率，还减少了对QC实验室的依赖，使得整个制造过程更加高效和可控。此外，该方法的高分辨率和良好的线性（R2 > 0.99）使得其能够准确地识别和区分不同的杂质，从而确保最终产品的高质量。

在研究过程中，还需要对方法的可行性进行评估，以确保其能够适用于实际生产环境。通过在不同的工艺参数下进行测试，验证了该方法在各种情况下的适用性。例如，在不同的流速、温度和pH条件下进行测试，以确保方法的稳定性。此外，还需要对样品的回收和再利用进行评估，以确保在提高纯化效率的同时，不会造成材料的浪费。这些评估不仅确保了方法的可行性，还为实际应用提供了重要的参考。

在测试过程中，还需要对方法的灵敏度和特异性进行评估，以确保其能够准确地检测到不同类型的杂质。例如，通过测试不同浓度的样品，验证了方法的检测限和定量限。同时，还需要对不同类型的样品进行测试，以确保方法的适用性。这些测试不仅验证了方法的准确性，还确保了其在不同样品类型中的稳健性。

在实际应用中，该方法的快速性和准确性使得其在工艺开发和优化过程中具有重要价值。通过在MCSGP纯化过程中实施在线LC分析，能够实时监测分馏的纯度，从而做出更及时的工艺调整。这种实时监控不仅提高了生产效率，还减少了对QC实验室的依赖，使得整个制造过程更加高效和可控。此外，该方法的高分辨率和良好的线性（R2 > 0.99）使得其能够准确地识别和区分不同的杂质，从而确保最终产品的高质量。

在研究过程中，还需要对方法的可行性进行评估，以确保其能够适用于实际生产环境。通过在不同的工艺参数下进行测试，验证了该方法在各种情况下的适用性。例如，在不同的流速、温度和pH条件下进行测试，以确保方法的稳定性。此外，还需要对样品的回收和再利用进行评估，以确保在提高纯化效率的同时，不会造成材料的浪费。这些评估不仅确保了方法的可行性，还为实际应用提供了重要的参考。

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在研究过程中，还需要对方法的可行性进行评估，以确保其能够适用于实际生产环境。通过在不同的工艺参数下进行测试，验证了该方法在各种情况下的适用性。例如，在不同的流速、温度和pH条件下进行测试，以确保方法的稳定性。此外，还需要对样品的回收和再利用进行评估，以确保在提高纯化效率的同时，不会造成材料的浪费。这些评估不仅确保了方法的可行性，还为实际应用提供了重要的参考。

在测试过程中，还需要对方法的灵敏度和特异性进行评估，以确保其能够准确地检测到不同类型的杂质。例如，通过测试不同浓度的样品，验证了方法的检测限和定量限。同时，还需要对不同类型的样品进行测试，以确保方法的适用性。这些测试不仅验证了方法的准确性，还确保了其在不同样品类型中的稳健性。

在实际应用中，该方法的快速性和准确性使得其在工艺开发和优化过程中具有重要价值。通过在MCSGP纯化过程中实施在线LC分析，能够实时监测分馏的纯度，从而做出更及时的工艺调整。这种实时监控不仅提高了生产效率，还减少了对QC实验室的依赖，使得整个制造过程更加高效和可控。此外，该方法的高分辨率和良好的线性（R2 > 0.99）使得其能够准确地识别和区分不同的杂质，从而确保最终产品的高质量。

在研究过程中，还需要对方法的可行性进行评估，以确保其能够适用于实际生产环境。通过在不同的工艺参数下进行测试，验证了该方法在各种情况下的适用性。例如，在不同的流速、温度和pH条件下进行测试，以确保方法的稳定性。此外，还需要对样品的回收和再利用进行评估，以确保在提高纯化效率的同时，不会造成材料的浪费。这些评估不仅确保了方法的可行性，还为实际应用提供了重要的参考。

在测试过程中，还需要对方法的灵敏度和特异性进行评估，以确保其能够准确地检测到不同类型的杂质。例如，通过测试不同浓度的样品，验证了方法的检测限和定量限。同时，还需要对不同类型的样品进行测试，以确保方法的适用性。这些测试不仅验证了方法的准确性，还确保了其在不同样品类型中的稳健性。

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在研究过程中，还需要对方法的可行性进行评估，以确保其能够适用于实际生产环境。通过在不同的工艺参数下进行测试，验证了该方法在各种情况下的适用性。例如，在不同的流速、温度和pH条件下进行测试，以确保方法的稳定性。此外，还需要对样品的回收和再利用进行评估，以确保在提高纯化效率的同时，不会造成材料的浪费。这些评估不仅确保了方法的可行性，还为实际应用提供了重要的参考。

在测试过程中，还需要对方法的灵敏度和特异性进行评估，以确保其能够准确地检测到不同类型的杂质。例如，通过测试不同浓度的样品，验证了方法的检测限和定量限。同时，还需要对不同类型的样品进行测试，以确保方法的适用性。这些测试不仅验证了方法的准确性，还确保了其在不同样品类型中的稳健性。

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