细菌分裂马达ToIQRA的分子机制解密：质子驱动力驱动的旋转运动与外膜稳定性维持

《Cell Discovery》：Deciphering the molecular mechanism of the bacterial division motor TolQRA

本研究针对革兰氏阴性细菌分裂过程中Tol-Pal系统维持外膜稳定性的分子机制不明确的问题，通过冷冻电镜技术解析了大肠杆菌ToIQRA复合物的多种构象状态结构，结合分子动力学模拟和功能验证，首次揭示了ToIQR作为质子驱动旋转马达的工作机制，鉴定了质子传导通道关键残基，为开发新型抗菌药物提供了重要靶点。

　　

在微生物世界的微观战场上，革兰氏阴性细菌拥有一套精妙的防御系统——外膜，这道天然屏障能有效阻挡抗生素等有害物质的入侵。然而，在细菌分裂的关键时刻，这道屏障需要经历复杂的重塑过程，包括肽聚糖层的重构和外膜的收缩。这一过程需要内膜、肽聚糖层和外膜三个包膜区室的精确协调，任何差错都可能导致细菌死亡。

在这场精密的"细胞分裂舞蹈"中，Tol-Pal系统扮演着指挥者的角色。特别是在细菌分裂的后期，这一系统负责协调新合成的隔膜肽聚糖层分离与外膜的收缩和内陷。系统功能异常会导致外膜稳定性破坏，增加细菌对抗菌剂的敏感性，使得Tol-Pal系统成为开发新型抗菌疗法的理想靶点。

尽管科学家们早已认识到Tol-Pal系统的重要性，但其核心组件——内膜复合物ToIQRA如何利用质子驱动力(PMF)在周质空间建立瞬时相互作用，从而协调细胞包膜重塑的具体分子机制，长期以来一直是个未解之谜。这一机制的黑箱状态严重制约了针对该系统的抗菌药物开发。

为了揭开这一谜团，来自四川大学华西医院、浙江大学、哥伦比亚大学等机构的研究团队在《Cell Discovery》上发表了最新研究成果。研究人员采用综合性的结构生物学和功能分析手段，成功解析了ToIQRA复合物的精细结构和工作机制。

研究团队主要运用了冷冻电镜技术、分子动力学模拟和细胞功能分析等方法。他们从大肠杆菌K12株系中克隆了ToIQRA操纵子，通过纳米盘和SMA聚合物两种方式重构复合物，利用300 kV Titan Krios显微镜收集数据。分子动力学模拟采用CHARMM36m力场，在GROMACS软件上进行微秒级模拟。功能验证则通过点稀释实验、显微镜观察和微量热泳动分析等技术完成。

ToIQRA复合物的整体结构

研究人员通过冷冻电镜解析了大肠杆菌ToIQRA复合物的结构，分辨率达到2.92-3.52 ?。结构显示，ToIQ形成五聚体结构，类似于MotA和ExbB，呈现火山状构型，具有狭窄的周质端和较宽的胞质基底。五聚体ToIQ通过其N端跨膜螺旋在周质端包裹二聚体ToIR。

在ToIQRA纳米盘复合物中，研究人员鉴定出三种主要重构结果，显示最多三个ToIA分子分别与ToIQ亚基ToIQ1、ToIQ3和ToIQ4结合。ToIA通过其跨膜螺旋(ToIA_I)以交叉构型与ToIQ相互作用，通过氢键稳定。

ToIQR复合物中质子通道的定位

研究团队在去质子化的ToIQR复合物中定位了质子通道。五聚体ToIQ结构在周质端附近有一个疏水区域，界定跨膜区，其余表面主要为亲水性。ToIR通过ToIR跨膜螺旋在疏水腔内与ToIQ结合。

ToIR跨膜螺旋通过富含亮氨酸的基序(L21LDVLLVLLL30)二聚化。该基序内的保守带电残基D23是同源原核运动蛋白共有的，被认为在质子结合和转移中发挥作用。不对称的ToIQ结构导致其五聚体亚基相对于中心ToIR轴的空间排列不均匀。

ToIQR马达单元的旋转运动

为了探索ToIQRA复合物的动态运动，研究人员使用苯乙烯-马来酸(SMA)聚合物捕获了其不同状态。获得了两种分辨率较高的不同结构类别，一类缺乏ToIA密度(称为ToIQ5R2)，另一类显示对应于一个ToIA拷贝的密度(称为ToIQ5R2A)。

这些结构以ToIR二聚体为参考进行叠加显示，与ToIQ5R2A3相比，ToIQ5R2结构略有旋转。ToIQ5R2A3和ToIQ5R2之间的形态转换显示，在相对于中心ToIR二聚体时，ToIQ的胞质末端有明显的百叶窗式旋转。

ToIA与ToIR周质结构域在二聚体界面相互作用

在冷冻电镜图中，研究人员还观察到一个卫星周质密度，位于ToIQ5和ToIQ1上方约60 ?处，可能对应于ToIR的周质结构域(ToIR_PDs)。先前报道的分离ToIR_PDs的晶体结构显示了两种不同构象：一种具有平坦界面，另一种具有弯曲界面。

据推测，ToIR_PD二聚体在激活时经历"链交换"重塑，其中一个单体旋转180°，将二聚体从C2对称转换为不对称架构。这种重塑的界面已被实验证明可介导肽聚糖结合，并类似于其他肽聚糖结合蛋白(如Pal、MotB和ExbD)的二聚体结构。

马达单元周质结构域的重塑

在预测结构中，ToIA的周质环采用伸展构型，而ToIR的环被压缩。这表明ToIR_PDs可能进一步延伸，但在当前构型中，其延伸受到ToIA环长度的限制。在激活的ToIR_PDs晶体结构中，ToIR_PDs的β6从二聚体界面缺失。

研究人员推测，马达单元的旋转驱动ToIR_PDs向肽聚糖层升高，这种向上运动促进了界面重塑，因为被束缚的ToIR_β6链被ToIA_β从二聚体界面拉离。支持这一模型的是，在ToIR界面将β6与β5共价交联会导致细菌在脱氧胆酸盐存在下死亡，表明ToIR_β6从界面解离对功能至关重要。

本研究通过综合结构生物学、计算模拟和功能分析，揭示了ToIQRA复合物作为质子驱动旋转马达的工作机制。研究首次在ToIQRA复合物中观察到了单列水链的形成，提出了质子传导的新路径，并阐明了ToIR周质结构域构象变化的分子基础。

这些发现不仅深化了对细菌分裂机制的理解，更重要的是为针对革兰氏阴性菌的新型抗菌药物开发提供了精准靶点。通过干扰ToIQR驱动的机械循环或ToIA-ToIR耦合，可能有效破坏细菌外膜稳定性，为解决抗生素耐药性这一全球健康挑战开辟了新途径。

该研究展示的多学科交叉研究方法——结合冷冻电镜结构生物学、分子动力学模拟和细胞功能验证——为研究其他复杂膜蛋白系统提供了可借鉴的范式。随着对这些细菌分裂机制的理解不断深入，我们将更有能力设计出精准针对病原体关键生命过程的下一代抗菌疗法。