一种针对免疫功能正常动物中软骨再生增强的时间程序化疗法

《Materials & Design》：A time-programmed therapy for enhanced cartilage regeneration in immunocompetent animals

时空协同调控的G5-IM/Mn纳米颗粒-GelMA水凝胶系统在软骨再生中的应用研究。摘要：本研究设计了一种时空协同的G5-IM/Mn纳米颗粒系统，通过表面偶联抗炎药物吲哚美辛（IM）和内核负载锰离子（Mn）实现分阶段释放。体外实验显示该系统显著抑制炎症反应并促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的软骨分化标志物（如SOX9、ACAN、Col2a1）表达。体内兔模型验证了该系统在抑制炎症细胞浸润的同时增强胶原II沉积和机械性能，证实了时空协同调控在软骨再生中的关键作用。

　　这项研究提出了一种基于时间调控的治疗策略，通过将抗炎药物吲哚美辛（IM）共价连接在第五代聚酰胺胺（G5）树枝状聚合物表面，并在内部封装锰（Mn）离子，构建了一种名为G5-IM/Mn的纳米粒子系统。该系统能够在IM快速释放后，持续释放Mn离子，从而精确匹配炎症控制和随后软骨再生的时间需求。研究结果表明，G5-IM/Mn纳米粒子在体外研究中显示出显著的抗炎效果，并且当它们被封装在甲基丙烯酸甲酯交联的明胶（GelMA）水凝胶中时，能够显著提升软骨标志物的表达水平，如SOX9、ACAN和Col2a1。在兔皮下植入模型中，该系统显著减少了CD3+和CD68+炎症细胞的浸润，同时增强了胶原蛋白II的表达和软骨基质的沉积。生化分析结果显示，GelMA@G5-IM/Mn组的糖胺聚糖和胶原蛋白II含量增加，以及杨氏模量的提升，进一步证明了该系统在软骨再生方面的潜力。研究总结指出，这种时间调控的G5-IM/Mn纳米粒子系统首先建立了有利于免疫的微环境，随后促进软骨组织的再生，为功能性软骨修复提供了新的材料解决方案。

软骨组织具有固有的自我修复能力受限，主要由于其缺乏血管、神经和淋巴管，以及致密的细胞外基质（ECM）等特性，使得临床干预面临重大挑战。为了克服这些局限性，软骨组织工程作为一种有前途的治疗方法应运而生，旨在再生结构和功能上与天然软骨相似的工程软骨。尽管在小鼠等免疫缺陷动物模型中取得了显著进展，但将这些治疗方法成功转化为免疫健全的动物和人类仍然受到很大限制。这主要是因为复杂的免疫系统会引发强烈的炎症反应，从而影响工程软骨的整合、存活和再生。

在软骨修复过程中，炎症主要源于植入生物材料的不相容性、材料降解过程中释放的酸性代谢物、植入引起的创伤，以及体外培养过程中组织特异性生物标志物的变化。这些炎症反应通过降低细胞活力和分化潜力，促进不必要的血管化和骨化，以及由巨噬细胞和成纤维细胞介导的纤维囊形成，从而严重阻碍软骨再生。因此，有效的炎症管理是实现免疫健全生物体中成功软骨再生的前提。

为缓解炎症反应，已有多种策略被探索。无支架的方法因其能消除生物材料相关的炎症刺激而受到关注，但这些技术面临关键挑战，包括细胞过度扩增增加细胞去分化风险，以及对软骨组织发育至关重要的机械支持不足。因此，结合抗炎特性的生物材料修饰引起了广泛关注。例如，通过微流控技术生产的抗炎微载体。然而，仅针对炎症控制的策略通常不足以实现软骨的完全再生，因为它们未能同时增强软骨特异性基质合成和分化。近年来，结合抗炎和促软骨因子的综合策略被提出，例如通过多重氢键交联的水凝胶，其中包含单宁酸、Kartogenin或dicerein等物质。然而，这些综合方法在大型免疫健全动物模型中仍缺乏最佳效果，表明关键因素可能被忽视。

研究提出，炎症控制和软骨再生之间的时间顺序对于最佳结果至关重要。具体而言，炎症是损伤后不可避免的早期反应，若未能适当控制，可能导致细胞凋亡和软骨细胞分化不良。此外，软骨再生需要一个免疫平衡的微环境，因为炎症抑制不足可能导致病理性纤维软骨组织形成。同时，炎症条件会显著影响关键软骨特异性基因如SOX9、ACAN和Col2a1的表达，突显了软骨形成过程对炎症介质如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的敏感性。因此，抗炎和促软骨干预的精确时间协调可能是实现成功软骨再生的关键。

在本研究中，G5-IM/Mn纳米粒子系统的设计基于空间分离的药物负载和相应的时间控制释放特性。IM通过稳定的酰胺键（–CO–NH–）共价连接到G5树枝状聚合物表面，而Mn离子则被封装在内部腔体中，通过静电相互作用和立体包裹实现稳定封装。这种双载荷策略形成了类似于核心-壳结构的体系，其中IM锚定在表面，Mn被限制在内部。EDS元素图谱进一步验证了G5-IM/Mn纳米粒子中成功引入Cl和Mn，而G5本身则不含这些元素，证明了IM和Mn在G5基质中的有效负载，同时保持其结构完整性。

研究结果显示，G5-IM/Mn纳米粒子在不同条件下的释放行为具有pH依赖性。在生理条件（pH 7.4）下，IM在前10天主要释放，达到约100%的累积释放。相比之下，Mn的释放则较为缓慢，从第6天开始逐渐释放，最终在第16天完全释放。在更酸性的条件（pH 6.8）下，IM的释放速度显著加快，达到100%的累积释放时间为第8天，而Mn的释放则在前4天几乎不发生，随后进入逐渐释放阶段，最终在第14天完成释放。在进一步降低pH至6.4的条件下，IM的释放速度加快，达到100%的累积释放时间为第8天，而Mn的释放则在前4天缓慢，之后在第4至14天间显著增加，最终在第14天完全释放。

这种pH依赖的释放行为可以归因于纳米粒子的结构和化学特性。IM分子通过EDC/NHS介导的偶联反应共价连接到G5的外围胺基上，形成可水解的酰胺键。这些键在水性条件下逐渐水解，而在酸性环境中水解过程明显加快，从而解释了在pH 6.8和6.4条件下IM的快速释放。相反，Mn离子通过静电相互作用和与三级胺的配位作用被物理封装在G5树枝状聚合物的内部腔体中，其释放受扩散和竞争离子交换控制。酸性环境促进内部胺基的质子化，削弱Mn-胺的配位作用，从而加速Mn2?离子的释放。重要的是，IM在所有测试条件下均比Mn更早和更快地释放，而Mn则表现出延迟和持续释放的模式。这种时间分离的释放特性是纳米粒子设计的内在属性，与pH变化无关，突显了G5-IM/Mn在分阶段和互补性治疗递送方面的潜力。

这种程序化释放行为与软骨损伤和修复的生物学时间线相一致。软骨损伤后的前7至10天被认为是急性炎症期，此时促炎性细胞因子升高，免疫细胞浸润达到高峰。因此，IM在0至10天内的早期释放可以有效抑制这一炎症级联反应，减少免疫激活，保护嵌入的骨髓间充质干细胞（BMSCs）免受炎症性损伤。一旦炎症得到控制，微环境变得有利于组织再生。此时，即在第6天之后，Mn的持续释放开始发挥其生物学作用，促进BMSC的软骨分化并刺激基质合成。

这些发现验证了G5-IM/Mn纳米粒子的空间分离药物负载设计及其相应的程序化释放特性。这种设计不仅提供了减少免疫干扰的治疗窗口，还确保了软骨形成的开始发生在有利的低炎症条件下。这样的策略为开发一种时间响应型水凝胶系统，实现高效的生物同步软骨再生奠定了基础。

在体外评估G5-IM/Mn纳米粒子的抗炎效果时，研究选择了IL-1β、IL-6和TNF-α作为代表性炎症标志物。Western blot结果表明，含有IM的组（G5-IM和G5-IM/Mn纳米粒子）在24小时治疗后，这些促炎性细胞因子的蛋白表达水平显著低于不含IM的组（对照组、G5和G5/Mn纳米粒子）。同样，qPCR结果也显示，G5-IM和G5-IM/Mn组中这些基因的表达水平显著低于对照组、G5和G5/Mn组。此外，为了进一步评估巨噬细胞极化，研究检测了M2巨噬细胞标志物CD206、Arg1和IL-10的表达水平。qPCR结果表明，G5-IM和G5-IM/Mn组中这些基因的表达水平显著高于对照组、G5和G5/Mn组，表明IM的引入有效促进了巨噬细胞向M2表型的极化。这些结果表明，IM的引入赋予了G5-IM/Mn纳米粒子显著的抗炎特性，既通过抑制促炎性细胞因子的表达，也通过上调抗炎性标志物。

此外，流式细胞术分析进一步确认了含有IM的纳米粒子的抗炎和免疫调节效果。在G5-IM和G5-IM/Mn纳米粒子处理后的RAW264.7细胞中，TNF-α+细胞（M1标志物）的比例显著降低，而CD206+细胞（M2标志物）的比例显著增加，与对照组、G5组和G5/Mn组相比。这些结果与qPCR和Western blot数据一致，进一步证明IM的引入有效改变了巨噬细胞的极化方向，从促炎性M1表型向抗炎性M2表型转变，从而增强了纳米粒子的免疫调节潜力。

免疫荧光染色进一步验证了巨噬细胞极化标志物的表达。在对照组、G5组和G5/Mn组中，iNOS（M1标志物）表现出强烈的红色荧光，而Arginase-1（M2标志物）的绿色荧光则几乎不可见。相比之下，G5-IM和G5-IM/Mn组中Arginase-1的绿色荧光显著增强，iNOS的表达则明显减少。这种向M2表型的极化进一步确认了IM在纳米粒子系统中的显著抗炎和免疫调节作用。

研究还评估了G5-IM/Mn纳米粒子和GelMA@G5-IM/Mn水凝胶的促软骨效果。通过共培养和3D培养模型，P2 BMSCs在9天的培养中表现出显著增强的aggrecan表达。免疫荧光分析显示，含有Mn的组（G5/Mn和G5-IM/Mn）中aggrecan和COL II的信号明显增强，支持Mn在促进软骨标志物表达中的作用。同时，qPCR分析确认了含有Mn的组中SOX9、ACAN和Col2a1基因的显著上调，表明Mn在促进BMSC软骨分化中的关键作用。Western blot分析和密度分析进一步显示，Mn处理的细胞中非磷酸化β-猫烯蛋白、磷酸化GSK-3β（Ser9）和磷酸化Smad2/3的水平显著增加，而总GSK-3β和总Smad2/3的水平基本保持不变。磷酸化比率在Mn处理组中显著升高，这表明Mn激活了Wnt/β-猫烯蛋白和TGF-β信号通路，为Mn在本系统中增强SOX9相关基因表达提供了机制基础。

此外，对GelMA@G5-IM/Mn水凝胶的生物相容性评估显示，所有组（包括对照组、GelMA、GelMA@G5、GelMA@G5-IM、GelMA@G5/Mn和GelMA@G5-IM/Mn）在第1天和第4天均表现出高细胞活力和良好的增殖能力。在荧光显微镜下，绿色荧光（活细胞）占主导，而红色荧光（死细胞）则很少。所有组中细胞分布均匀，各组之间没有显著的细胞活力差异。FITC-phaeoidin染色进一步显示，所有组中的BMSCs保持高度的活力，具有圆形的细胞核和良好的细胞形态，显示出从第1天到第4天的显著增殖能力。CCK-8检测获得的OD值也证实了所有水凝胶组中BMSCs增殖的显著时间依赖性，与对照组相当。定量分析显示，第1天和第4天，所有六组的细胞活力均接近100%，且无显著差异。这些结果表明，G5、IM和Mn的引入并未对GelMA的生物相容性造成不利影响，支持了该系统在体内抗炎和促软骨应用中的进一步探索。

在体内评估GelMA@G5-IM/Mn水凝胶的抗炎效果时，BMSCs负载的水凝胶被植入兔子皮下。免疫荧光染色显示，含有IM的组（GelMA@G5-IM和GelMA@G5-IM/Mn）在植入后2周和6周时，CD3+和CD68+炎症细胞的正染色面积显著低于不含IM的组（GelMA、GelMA@G5和GelMA@G5/Mn）。这些结果表明，IM在体内有效抑制了T细胞和巨噬细胞的炎症浸润，显著降低了免疫激活水平，从而建立了有利于组织修复的低炎症微环境。此外，ELISA分析显示，含有IM的水凝胶在植入后2周和6周时，M1相关促炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的水平显著降低，而M2相关抗炎性和再生性细胞因子（IL-10、TGF-β）的水平显著升高。这些发现表明，IM的引入有效抑制了促炎反应，同时促进了抗炎信号，推动了巨噬细胞从M1表型向M2表型的极化，从而建立了有利于组织修复和再生的免疫调节微环境。

在体内评估GelMA@G5-IM/Mn水凝胶的软骨再生效果时，通过H&E、Safranin-O染色和COL II免疫组化分析，评估了炎症细胞浸润和软骨特异性特征。GelMA@G5-IM/Mn组表现出优于其他组的软骨再生效果，表现为更明显的软骨空腔、更丰富的基质沉积和更强的COL II表达。相比之下，不含IM的组（GelMA、GelMA@G5和GelMA@G5/Mn）在2周时已表现出显著的炎症细胞浸润，且这种现象持续到6周。这表明IM在体内有效抑制了炎症反应。此外，与不含Mn的组（GelMA、GelMA@G5和GelMA@G5-IM）相比，含有Mn的组（GelMA@G5/Mn和GelMA@G5-IM/Mn）在2周时已显示出软骨空腔的形成和COL II的沉积，6周时观察到更成熟的空腔结构和增强的COL II积累，支持了Mn在促进软骨基质再生中的作用。此外，GelMA@G5-IM/Mn组的COL II沉积比GelMA@G5/Mn组更为显著，表明IM在增强Mn介导的软骨分化中具有协同效应。这些发现表明，该复合系统不仅有效抑制了炎症，还具备显著的促软骨潜力。值得注意的是，Safranin-O染色中观察到的大量富含蛋白聚糖的基质进一步证实了基质合成的活跃状态。

生化成分的定量评估进一步表明，GelMA@G5-IM/Mn组在促进软骨再生和减轻炎症方面表现出更优的性能。增加的糖胺聚糖和胶原蛋白II含量表明，该水凝胶系统有效支持了软骨基质的合成和沉积。此外，机械分析中观察到的杨氏模量的提升反映了增强的机械性能，表明再生组织更接近天然软骨的功能性要求。

研究中选择的适当抗炎和促软骨剂或生物因子是关键因素。IM作为一种非甾体抗炎药（NSAID），通过抑制COX-1和COX-2表现出镇痛和抗炎效果。已有研究表明，IM的抗炎效果更强且安全性更高，比其他NSAIDs更适用于局部软骨组织工程。Mn已被证明对软骨基质重建有积极影响，能够增强ACAN和SOX9的表达。因此，IM的抗炎效果和Mn的促软骨能力可能协同促进软骨再生。

在软骨修复过程中，保护软骨细胞免受炎症损伤，然后促进基质分泌是实现成功修复的关键。预先抑制炎症为有效的再生奠定了基础。然而，当前的方法在抗炎和BMSC软骨分化过程中缺乏时间控制，导致软骨再生效果不佳。因此，有必要开发能够递送时间控制治疗信号的组织工程支架，以在启动软骨再生之前建立抗炎微环境。这种时间调控对于实现有效的软骨修复至关重要。

总之，这项研究提出了一种新型的时间调控组织工程策略，通过精确控制抗炎和促软骨过程的顺序，为功能性软骨再生提供了实际可行的材料解决方案。该策略不仅在体外表现出良好的生物相容性、抗炎能力和促软骨诱导效果，而且在体内实验中也证实了其有效抑制局部炎症反应、显著增强软骨特异性基质形成和改善再生组织的机械性能。这种时间调控的策略为软骨组织工程的临床转化提供了新的思路和方法，具有重要的应用前景。