基于LC-MS/MS的TCA循环代谢物精准定量方法开发及其在乙醇诱导代谢紊乱研究中的创新应用

《Microchemical Journal》：Comprehensive LC-MS/MS quantification of TCA cycle metabolites in rat biofluids and human hepatic organoids: Application to binge ethanol-induced metabolic dysregulation

本研究针对TCA循环代谢物定量分析中存在的基质效应、内源性背景干扰等难题，开发了三种基质特异性LC-MS/MS方法，成功应用于大鼠和人类肝类器官的乙醇暴露模型。研究发现乙醇会引发组织特异性的TCA循环紊乱：大鼠表现为特定酶活性瓶颈，而人类肝类器官则显示能量代谢受损。该研究为酒精性肝病的机制研究提供了可靠的分析平台。

　　

在生命科学领域，三羧酸循环(TCA cycle)作为细胞能量代谢的核心枢纽，其代谢物的动态变化被视为反映机体代谢状态的"晴雨表"。然而，由于生物样本中内源性物质的干扰、缺乏无分析物基质以及复杂的基质效应，TCA循环代谢物的准确定量一直面临严峻挑战。更令人担忧的是，现有液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法在平行性验证、内标使用覆盖度和验证标准严谨性等方面存在明显不足，导致定量结果的可靠性存疑。

与此同时，酒精滥用引发的健康问题日益严重，特别是暴饮乙醇行为在年轻人群中的流行，使得深入研究乙醇对能量代谢的影响机制变得尤为迫切。虽然已有研究表明乙醇会干扰线粒体功能并改变TCA循环代谢物水平，但关于暴饮乙醇如何特异性影响不同生物基质中TCA循环的定量研究仍显不足。

针对这一科学难题，来自启明大学药学院的Ye Jin Jung等研究者在《Microchemical Journal》上发表了创新性研究成果。他们开发了三种基质特异性的LC-MS/MS分析方法，分别适用于大鼠尿液(方法1)、大鼠血浆(方法2)和人类肝类器官培养基(方法3)，实现了10种TCA循环代谢物的同步精准定量。研究团队采用水作为替代基质制备校准品，并通过平行性评估和基质效应考察验证了该策略的可行性。

关键技术方法包括：基于质量控制的基质特异性色谱梯度优化，采用水作为替代基质的校准策略验证，通过平行性实验评估基质适用性，稳定同位素内标校正基质效应，以及在大鼠暴饮乙醇模型(4 g/kg乙醇，40% v/v，12小时间隔灌胃，持续3天)和人类肝类器官乙醇暴露模型(200 mM乙醇处理24小时)中的应用验证。

基质特异性优化梯度条件

研究人员通过精细优化色谱梯度条件，成功实现了柠檬酸和异柠檬酸等异构体的基线分离。尽管混合模式阴离子交换或亲水作用色谱(HILIC)能提高异构体选择性，但它们可能带来与常规LC-MS/MS生物分析不兼容的限制。优化后的方法在所有基质中均表现出良好的色谱分离效果，为准确定量奠定了基础。

方法验证

验证结果表明，所有方法均具有良好的选择性、灵敏度、准确度和精密度，校准曲线在各自范围内呈现可接受的线性。水作为替代基质的有效性通过平行性实验得到证实，且基质效应在可控范围内。稳定性评估显示各代谢物在不同处理条件下均保持稳定，确保了分析结果的可靠性。

乙醇诱导的代谢扰动

应用验证的方法，研究人员发现乙醇暴露引发了明显的基质特异性TCA循环扰动。在大鼠模型中，代谢紊乱模式与特定TCA相关酶活性瓶颈一致；而在人类肝类器官中，改变主要表现为能量代谢受损和肝功能受损。这些差异揭示了乙醇在不同生物系统中代谢影响的特异性，强调了在靶器官和外周液体中准确量化TCA循环代谢物的重要性。

结论

该研究建立的基质特异性LC-MS/MS方法成功解决了内源性TCA循环代谢物定量分析中的关键技术难题，为研究乙醇相关代谢紊乱机制提供了可靠平台。研究证实水可作为合适的替代基质，方法验证显示了良好的准确度、精密度和稳定性。乙醇暴露实验揭示了物种和基质特异性的TCA循环扰动模式，为大鼠和人类肝类器官中乙醇诱导代谢紊乱的机制解读提供了新的见解。这些发现不仅深化了对乙醇代谢影响的理解，也为相关疾病的生物标志物发现和代谢通路研究提供了有力的分析工具。

该研究的创新之处在于首次系统评估了替代基质的平行性，建立了全面覆盖10种TCA循环代谢物的多基质分析方法，并首次在人类肝类器官模型中系统研究乙醇对TCA循环的影响。研究方法严谨，验证充分，为代谢组学研究提供了可借鉴的分析策略，在酒精性肝病机制研究和临床转化方面具有重要价值。