乳酸化修饰调控精子运动功能：弱精子症中乳酸化蛋白质组学的新发现

《Molecular & Cellular Proteomics》：Lactylated proteomic analysis reveals functional implications of lysine lactylation in asthenozoospermia

本研究针对弱精子症(AZS)发病机制不明的问题，通过乳酸化蛋白质组学分析揭示了精子蛋白乳酸化修饰在调控精子运动功能中的关键作用。研究发现PGK2K220位点乳酸化通过影响糖酵解通路和ATP生成调控精子运动，为男性不育诊疗提供了新靶点。

　　

全球范围内不孕不育率呈现逐年上升趋势，世界卫生组织数据显示已达17.5%，其中男性因素约占50%。弱精子症（asthenozoospermia, AZS）作为男性不育的主要病因，约占男性不育病例的81%，其特征是精子前向运动比例低于32%。随着全球男性精液质量下降，AZS的发病率显著上升，已成为生殖健康领域的重要公共卫生问题。

精子作为男性体内分化程度最高的细胞类型之一，在成熟过程中失去转录能力，其细胞质核糖体也失去翻译活性。因此，精子功能的调控主要发生在蛋白质水平，蛋白质翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）在精子功能中发挥着重要作用。人类精子鞭毛的能量供应高度依赖于糖酵解产生ATP，同时产生大量乳酸。近年来突破性研究发现，乳酸可参与形成组蛋白乳酸化修饰，这是一种通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术发现的新型蛋白质修饰。随后的研究表明，从单细胞生物到人类，赖氨酸乳酸化（lysine lactylation, Kla）在进化上具有保守性且广泛存在。

然而，作为PTMs家族的新成员，乳酸化修饰在男性生殖系统特别是精子功能调控中的作用尚未得到充分探索。南京医科大学附属逸夫医院检验科的研究团队在《Molecular》杂志上发表的研究，首次系统揭示了精子蛋白质乳酸化修饰的调控网络及其在弱精子症发病机制中的重要作用。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过Percoll密度梯度离心法从临床采集的正常和弱精子症精液样本中分离精子；利用基于LC-MS/MS的乳酸化蛋白质组学技术鉴定精子中的乳酸化蛋白；采用免疫荧光染色观察乳酸化蛋白的亚细胞定位；通过免疫共沉淀（IP）验证特定蛋白的乳酸化水平；使用酶活性检测试剂盒测定PGK2酶活性；通过ATP和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）检测试剂盒分析糖酵解产物水平；在293T细胞中进行点突变实验验证特定位点的功能。

研究结果部分，首先发现精子蛋白乳酸化水平在弱精子症中降低。Western blot分析显示，正常人类精子中存在多种分子量的乳酸化蛋白，免疫荧光染色进一步表明这些乳酸化蛋白分布在精子鞭毛、顶体和细胞核上。与正常对照相比，弱精子症精子中蛋白Kla水平显著降低，提示异常蛋白乳酸化可能是弱精子症精子运动障碍的重要机制。

乳酸调控精子运动和蛋白乳酸化的研究发现，外源性乳酸钠和线粒体呼吸链复合体I抑制剂鱼藤酮（rotenone）均可显著提高精子运动力和前向运动力，而乳酸脱氢酶抑制剂草酸盐（oxamate）则以浓度依赖方式降低精子运动力。Western blot和免疫荧光分析证实，草酸盐处理可抑制精子蛋白乳酸化水平，特别是鞭毛区域的乳酸化信号明显减弱。

蛋白质组学分析揭示了人类精子中多样的乳酸化蛋白。研究共鉴定出220个乳酸化蛋白，包含557个乳酸化位点，其中54.1%的乳酸化蛋白定位于细胞质和细胞核。Motif分析显示K和L是乳酸化位点周围最富集的氨基酸残基。

功能富集分析表明，精子乳酸化蛋白显著富集于糖酵解通路和精子运动相关生物学过程。值得注意的是，糖酵解关键酶磷酸甘油酸激酶2（phosphoglycerate kinase 2, PGK2）存在10个乳酸化位点（K6、K11、K31、K41、K141、K192、K220、K272、K322和K353），PGK2作为睾丸特异性表达的糖酵解酶，在糖酵解和ATP生成中起关键作用。

PGK2乳酸化通过调控糖酵解过程影响弱精子症精子运动的研究显示，PGK2催化1,3-二磷酸甘油酸和ADP转化为3-磷酸甘油酸（3-PG）和ATP，这是糖酵解过程中ATP产生的第一步。鱼藤酮和乳酸钠处理可提高PGK2酶活性，而草酸盐则显著抑制其活性。相应地，PGK2下游产物ATP和PEP的浓度在鱼藤酮和乳酸钠处理后升高，而在草酸盐处理后降低。免疫共沉淀实验证实，鱼藤酮和乳酸钠显著提高PGK2乳酸化水平，而草酸盐则降低其乳酸化水平。重要的是，外源性补充ATP和3-PG可有效逆转草酸盐对精子运动力的抑制作用。

在临床样本分析中，弱精子症精子中PGK2酶活性显著低于正常对照，同时精浆中ATP和PEP水平也明显降低。PGK2乳酸化水平在弱精子症精子中下调，而外源性补充ATP和3-PG可恢复弱精子症精子的运动力。此外，弱精子症精浆中乳酸含量显著降低，外源性补充乳酸钠可改善弱精子症精子的运动力。

PGK2（K220）位点乳酸化通过调控酶活性影响糖酵通的研究发现，PGK2 K220位点与ATP形成两个氢键。通过将K220位点赖氨酸（K）突变为精氨酸（R），研究人员证实K220R突变不仅降低PGK2乳酸化水平，还显著减少糖酵解通路中PGK2下游产物ATP和PEP的生成，表明PGK2 K220位点乳酸化在ATP产生中发挥重要调控作用。

研究结论与讨论部分指出，蛋白质Kla在人类精子运动功能中具有重要调控作用。弱精子症患者精子蛋白乳酸化水平下调，其中PGK2 K220位点乳酸化异常通过影响酶活性和PEP、ATP生成，导致精子运动缺陷。补充PGK2下游产物和乳酸处理可挽救精子运动缺陷，表明异常蛋白乳酸化是弱精子症的重要致病因素。

该研究首次系统揭示了精子蛋白质乳酸化修饰的特征和功能，发现糖酵解通路关键酶PGK2的乳酸化修饰通过调控酶活性影响ATP生成，进而参与精子运动调控。弱精子症中PGK2乳酸化水平下降导致糖酵解障碍和精子运动力降低，这为理解弱精子症的分子机制提供了新视角。研究还发现PGK2 K220位点既可发生乳酸化修饰，也可发生乙酰化修饰，两种修饰可能存在交叉对话，值得进一步研究。

这些发现拓展了对精子蛋白乳酸化修饰的认识，为男性不育的精准诊断和治疗提供了理论依据。未来研究需要进一步阐明乳酸化修饰的酶调控网络，解析弱精子症的发病机制，为开发新的治疗策略奠定基础。该研究不仅为生殖医学领域提供了重要的基础数据，也为蛋白质翻译后修饰研究开辟了新的方向。