高效液相色谱-质谱法精准定量高浓度N,N-二甲基甲酰胺药品中N-亚硝基二甲胺的研究

《Organic Preparations and Procedures International》：Accurate Quantitation of N?Nitrosodimethylamine in Pharmaceutical Products with High Levels of N, N?Dimethylformamide by HPLC-MS

本研究针对药品中致癌物N-亚硝基二甲胺(NDMA)检测面临的高浓度N,N-二甲基甲酰胺(DMF)干扰难题，开发了基于Evosphere AQUA色谱柱的HPLC-MS方法。该方法成功实现了NDMA与DMF的基线分离（浓度差达100万倍），定量限达0.3 ng/mL，并通过ICH指南验证。为解决DMF引起的假阳性和假阴性问题提供了可靠方案，适用于二甲双胍等药品的质控检测。

　　

在医药安全领域，亚硝胺污染犹如潜伏的"隐形杀手"。2018年，降压药缬沙坦中首次检出强致癌物N-亚硝基二甲胺(NDMA)的事件引发全球关注，随后在雷尼替丁、二甲双胍等常用药物中相继发现其踪迹。这类亚硝胺化合物不仅具有强致癌性，其检测还面临着一个特殊挑战：常用溶剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的严重干扰。

问题的核心在于NDMA的极性和弱保留特性。大多数反相液相色谱柱难以有效分离NDMA和DMF，而DMF在药品中的浓度往往比NDMA高出数个数量级。这种巨大的浓度差导致两个严重后果：一是DMF的同位素峰（如¹⁵N DMF）可能被误判为NDMA，造成假阳性；二是高浓度DMF会抑制NDMA的电离，导致假阴性。即使采用高分辨率质谱技术，这一难题仍未得到根本解决。

面对这一行业痛点，默克公司的Mikhaila D. Ritz团队在《Organic Preparations and Procedures International》上发表了一项创新研究。他们通过系统的方法开发，建立了一种稳健的HPLC-MS分析方法，成功实现了NDMA与DMF的精准分离检测。

关键技术方法包括：采用Evosphere AQUA色谱柱进行色谱分离优化，使用0.05%三氟乙酸-乙腈体系作为流动相，通过Waters QDa单四极杆质谱仪进行检测。针对不同剂型（普通片与缓释片）建立了相应的样品前处理流程，并通过ACD/Laboratories色谱模拟软件进行方法优化与稳健性评估。

3.1. DMF对NDMA定量的干扰

研究人员首先通过实验证实了DMF干扰的双重机制：当DMF与NDMA共洗脱时，¹⁵N DMF（m/z 75.0571）会干扰NDMA（m/z 75.0553）的检测，导致假阳性；同时高浓度DMF会引起明显的离子抑制效应，造成假阴性。使用FDA方法的实验数据显示，随着DMF浓度从0增加到50 μg/mL，NDMA的峰面积显著降低，且在DMF出峰位置观察到基线凹陷，这是离子抑制的典型特征。

3.2. 方法开发

3.2.1. 色谱柱筛选

团队评估了8种亲水型C₁₈色谱柱，发现Fortis Evosphere AQUA柱表现最佳，NDMA与DMF的分离度达到7.3，远优于其他色谱柱。这种优异的分离性能为消除DMF干扰奠定了基础。

3.2.2. 流动相筛选

比较乙腈和甲醇作为有机相，以及甲酸和三氟乙酸作为添加剂的影响。结果表明，乙腈体系能产生更尖锐的NDMA色谱峰，而0.05%三氟乙酸体系能降低NDMA-d₆内标的基线噪音，因此选择乙腈-0.05%三氟乙酸体系作为最优流动相。

3.2.3. TFA-乙腈方法的优化

利用色谱模拟软件对梯度条件进行优化，最终确定的方法中NDMA与基质峰的最小分离度为3.61，确保了方法的稳健性。优化后的色谱图显示，NDMA、DMF和基质组分均实现了良好分离。

3.2.4. QDa参数优化

通过系统优化质谱参数，发现探头温度600°C、锥孔电压17V、毛细管电压1.5kV时，NDMA的信噪比最佳。这些优化使方法在单四极杆质谱仪上也能获得足够的灵敏度。

3.3. 方法表征

3.3.1. DMF的干扰

验证实验表明，即使DMF浓度高达1000 μg/mL（相当于NDMA浓度的100万倍），新方法仍能准确定量1 ng/mL的NDMA。在二甲双胍原料药中，DMF的规范限值为880 ppm，对应样品溶液中最大浓度为88 μg/mL，远低于方法耐受限度，证明该方法在实际应用中的可靠性。

3.3.2. 方法验证

按照ICH Q2(R2)指南进行的全面验证显示：方法在0.3-10 ng/mL范围内线性良好（R>0.999）；检测限为0.1 ng/mL（信噪比3-5），定量限为0.3 ng/mL（信噪比17-22）；加标回收率在使用内标时为99-104%，精密度RSD小于10%。这些指标均满足法规要求。

该研究的成功不仅体现在方法本身的性能上，更在于其解决实际问题的能力。通过巧妙的色谱柱选择和条件优化，研究人员突破了传统方法的局限，即使使用常规的单四极杆质谱仪也能实现高灵敏度的NDMA检测。这种方法的经济性和易用性使其特别适合质量控制实验室的常规分析。

值得注意的是，该方法具有广泛的适用性，可扩展至缬沙坦、雷尼替丁等其他存在亚硝胺风险的药品检测。随着监管要求的日益严格，特别是在使用DMF等风险溶剂的合成工艺中需要进行NDMA确认检测的背景下，这一方法为制药行业提供了及时而实用的解决方案。

这项研究的创新之处在于将方法开发的重点放在解决实际检测难题上，而非单纯追求仪器的高配置。通过"巧用"常规设备实现"精准"检测，体现了分析方法开发的智慧，也为解决其他类似的分析挑战提供了有益借鉴。在药品安全日益受到重视的今天，这种以问题为导向的方法开发策略具有重要的示范意义和推广价值。