丹参源纳米囊泡多组学表征与功能研究：跨物种调控治疗动脉粥样硬化的新策略

《Pharmacological Research - Natural Products》：Multi-omics Profiling and Functional Characterization of Salvia miltiorrhiza-derived nanovesicles: A Novel Therapeutic Approach for Atherosclerosis via Cross-Kingdom nanovesicle Regulation

本研究针对动脉粥样硬化（AS）现有疗法副作用大的临床难题，系统开展了丹参源纳米囊泡（SDNV）的多组学表征与功能验证研究。通过超速离心技术成功提取高纯度SDNV，结合miRNA测序、代谢组学、脂质组学和蛋白组学分析，发现SDNV-D富含具有抗AS活性的miRNAs、丹参酮类代谢物和脂质成分。动物实验证实SDNV-D通过TLR4/NLRP3炎症通路显著降低AS模型小鼠血脂水平、抑制动脉斑块形成。该研究首次揭示植物源纳米囊泡通过跨物种基因调控发挥心血管保护作用，为天然药物研发提供了新思路。

　　

在心血管疾病领域，动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）作为一种慢性炎症性疾病，始终是全球范围内导致死亡的主要原因之一。尽管他汀类和抗血小板药物在临床治疗中广泛应用，但长期使用可能引发肝损伤、肌肉疼痛和出血等副作用，这严重制约了现有疗法的应用效果。面对这一临床困境，研究人员将目光投向了传统中药丹参——这种常用于治疗心血管疾病的药用植物，但其已知活性成分仍不能完全解释其显著的临床疗效。

近年来，纳米囊泡（nanovesicles）作为直径10-1000纳米的磷脂双分子层结构，因其能够携带miRNA、蛋白质和代谢物等多种生物活性物质，在跨物种信息传递中展现出巨大潜力。特别值得注意的是，植物源纳米囊泡具有来源广泛、生物相容性好、免疫原性低等优势，为疾病治疗提供了新思路。然而，关于丹参源纳米囊泡（Salvia miltiorrhiza-derived nanovesicles, SDNV）的研究仍相对有限。

在这项发表于《Pharmacological Research - Natural Products》的研究中，吴若瑜、张瑞等研究人员开展了一项系统性的探索。他们分别从栽培一年的丹参煎剂（SDNV-D）和鲜根汁液（SDNV-F）中提取纳米囊泡，通过超高速差速离心和蔗糖浓度梯度离心技术获得高纯度样品。研究团队运用Illumina SE50平台进行miRNA测序，采用液相色谱-串联质谱技术分析代谢物、脂质和蛋白质组成，并通过生物信息学工具预测miRNA的靶基因。

在技术方法层面，研究人员首先通过超速离心技术从丹参材料中分离纳米囊泡，利用透射电镜观察其形态结构，采用纳米颗粒跟踪分析仪测定粒径分布和浓度。通过sRNA高通量测序分析miRNA组成，运用非靶向代谢组学和脂质组学技术鉴定活性成分，并利用蛋白质组学分析蛋白质组成。在功能验证方面，通过动物实验评估SDNV-D对ApoE^-/-模型小鼠的干预效果，采用细胞实验研究SDNV-D对ox-LDL诱导的小鼠主动脉血管平滑肌细胞（MOVAS）的影响，并运用分子生物学技术检测相关信号通路指标。

表征纳米囊泡

研究人员成功提取的SDNV-D和SDNV-F呈淡黄色沉淀，易溶于PBS。透射电镜显示两种纳米囊泡均具有明显的杯状结构和完整双分子层膜。纳米颗粒跟踪分析表明粒径主要分布在10-200纳米之间，平均约115纳米，zeta电位分别为-6.7mV和-11.9mV，符合典型纳米囊泡特征。

miRNA测序

sRNA测序结果显示，SDNV-D组鉴定出52个已知miRNA，属于9个miRNA家族；SDNV-F组鉴定出110个已知miRNA，属于28个家族。两组共有的高表达miRNA家族包括miR159、miR166、miR319和miR396。值得注意的是，即使在高温煎煮条件下提取的SDNV-D中仍检测到丰富的miRNA，这可能得益于纳米囊泡的物理屏障作用和miRNA的甲基化修饰。

预测miRNA人类靶基因及富集分析

通过miRanda软件预测人类靶基因，发现SDNV-D和SDNV-F中的miRNA可能参与炎症、血管生成和细胞凋亡等过程。GO富集分析显示靶基因显著富集于蛋白结合、生物合成调控、程序性细胞死亡和脂质代谢等生物学过程。KEGG分析提示这些miRNA可能通过NF-κB、TNF、PI3K-Akt和Toll样受体等信号通路参与心血管疾病发生。

代谢组学测序

在正负离子模式下共鉴定到1132种代谢物，其中脂质和类脂分子占比最高。SDNV-D组中丹参酮I（Tanshinone I）和丹参酮II（Tanshinone II）的相对丰度显著高于SDNV-F组，而磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的含量则相对较低。KEGG富集分析表明差异代谢物主要参与苯丙烷生物合成、血管平滑肌收缩和酪氨酸代谢等通路。

脂质组学测序

研究人员鉴定到1436种脂质分子，涵盖7大类49亚类。甘油酯和甘油磷脂约占脂质总量的一半，其中甘油三酯、甘油二酯和氧化甘油三酯是甘油酯的主要成分，而磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和N-乙酰乙醇胺则是甘油磷脂的主要组成。与SDNV-F相比，SDNV-D中大多数脂质分子的相对表达水平下降，其中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸和甘油二酯差异最为显著。

蛋白质组学测序

由于SDNV-D经过高温处理，蛋白质发生变性，未能检测到完整蛋白结构。而SDNV-F中鉴定到4099种蛋白质，GO富集分析显示这些蛋白质涉及多种分子功能、细胞组分和生物过程。KEGG分析表明其主要参与内质网蛋白质加工、糖酵解/糖异生以及淀粉和蔗糖代谢等通路。

多组学整合分析

通过整合miRNA组学、非靶向代谢组学和脂质组学数据，研究人员系统解析了SDNV-D中活性成分的协同调控逻辑。研究发现，NF-κB信号通路在多个组学层面均出现富集，成为AS相关炎症的核心介质。SDNV-D中的miRNA可靶向NF-κB上游调控因子，而丹参酮I/IIA和丹酚酸B等代谢物则能直接抑制NF-κB活化，形成"双重抑制"效应。此外，TLR4信号通路也呈现出层次化调控特征：上游miRNA直接靶向TLR4，中游甘油磷脂代谢影响TLR4膜定位，下游抗炎脂质介质产生抑制炎症级联反应。

SDNV-D的生物安全性

为期28天的干预研究表明，SDNV-D在100μg/只的剂量下未引起小鼠明显毒性反应。HE染色显示主要器官无病理损伤，血清肝功能指标（ALT、AST、TBIL、ALB、TP）、肾功能指标（Scr、BUN、Urea）以及血脂四项（TC、TG、LDL-C、HDL-C）与对照组无显著差异，证实了SDNV-D长期使用的安全性。

体内SDNV-D示踪及其对小鼠的干预效果

Dir标记实验显示SDNV-D主要通过尾静脉注射后分布于肝脏、脾脏和肺脏，主动脉和肠道中也有少量分布。在ApoE^-/-模型小鼠中，SDNV-D干预显著降低血清TC、TG和LDL-C水平，效果优于阿托伐他汀阳性对照组。油红O染色和HE染色结果表明SDNV-D有效延缓了主动脉斑块形成，ELISA检测显示其能降低TNF-α和IL-6水平，同时升高IL-10水平。

免疫组化染色显示SDNV-D显著降低AS模型小鼠主动脉中TLR4、NF-κB、pNF-κB、NLRP3、Caspase-1和GSDMD的蛋白表达水平。免疫荧光染色进一步证实SDNV-D减少主动脉斑块中NLRP3水平和M1型巨噬细胞比例，增加M2型巨噬细胞。qRT-PCR结果同样表明SDNV-D有效降低TLR4、NF-κB、NLRP3、Caspase-1和GSDMD的mRNA水平。

SDNV-D对ox-LDL诱导的MOVAS细胞的干预作用

细胞实验表明，PKH26标记的SDNV-D可被MOVAS细胞有效内化并定位于细胞质。在无细胞毒性的浓度下（60μg/mL），SDNV-D显著抑制ox-LDL诱导的MOVAS细胞异常增殖和迁移。ELISA检测显示SDNV-D降低细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子水平，qRT-PCR结果证实其下调TLR4/NLRP3通路关键指标的mRNA表达。

研究结论与讨论部分指出，该研究首次系统表征了丹参源纳米囊泡的多组学特征，发现SDNV-D富含具有抗AS活性的miRNAs、丹参酮类代谢物和脂质成分。通过体内外实验证实SDNV-D可通过TLR4/NLRP3炎症通路显著改善血脂代谢、抑制动脉斑块形成。特别值得注意的是，即使在高温煎煮条件下，SDNV-D仍能保持生物活性，这为传统中药煎剂的现代化研究提供了新视角。

这项研究的创新之处在于揭示了植物源纳米囊泡通过跨物种基因调控发挥心血管保护作用的分子机制，为天然药物研发提供了新思路。SDNV-D作为一种天然纳米载体，兼具药物递送和治疗双重功能，在心血管疾病治疗领域展现出广阔的应用前景。未来研究可进一步探索SDNV-D中特定活性成分的协同作用机制，以及其在其他炎症相关疾病中的潜在应用价值。