组织特异性免疫抑制性和增殖型巨噬细胞促进了人类结直肠癌早期向肝脏转移的进程 开放获取

《Cancer Immunology Research》：Tissue-Specific Immunosuppressive and Proliferating Macrophages Fuel Early Metastatic Progression of Human Colorectal Cancer to the Liver Open Access

结直肠癌肝转移（CRLM）中肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的转录组异质性和功能多样性研究。通过单细胞RNA测序分析3例患者的结肠和肝转移灶TAM，发现结肠以炎症型TAM（高表达促炎基因如CCL3、CXCL8）为主，而肝转移灶免疫调节型TAM（高表达免疫检查点CTLA4、TIM3）显著富集，且后者与CD163+ PCNA+ TAM共定位，预示更短的疾病无进展生存期（HR=6.48, P=0.018）。通过轨迹分析和模块评分，揭示肝TAM存在增殖特征（S/G2M期高表达基因如RPL11、RPL10），且免疫抑制性通路（IL10、TGFβ1）和抗炎基因（CD163、S100A8）在肝转移灶中显著激活。本研究为靶向肝TAM免疫微环境提供了分子基础。

　　早期同步性结直肠癌肝转移（CRLM）是一种临床状况，其特征是原发性结直肠癌和转移性肝病变同时存在。在这项研究中，我们分析了结直肠癌和CRLM样本中肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的组织特异性转录组、表型和功能相关性。通过高通量单细胞转录分析，我们发现结直肠癌和CRLM的TME中，炎症性和免疫调节性TAM的比例呈现逆向关系，同时这两个组织中也表现出高度的异质性。此外，我们还发现结直肠癌中的炎症性TAM表达了抑制性配体，这些配体可能支持免疫逃逸，从而促进肝转移的发生。相比之下，CRLM病变具有高度的免疫抑制性微环境，其特征是存在大量增殖的CTLA4+免疫调节性TAM和细胞毒性IL7R+ TAM。这些特定的TAM亚群频率较高与较差的疾病无进展生存期和更差的患者预后相关。识别和表征优先富集在CRLM中的免疫调节性TAM对于开发新的免疫治疗策略至关重要，以增强TME中的抗癌免疫反应。

研究背景表明，结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其中超过50%的患者会发展为结直肠癌肝转移（CRLM）。在这些病例中，同步性CRLM是一种特别具有挑战性的临床实体，约占结直肠癌病例的15%至25%。这种临床情况反映了疾病的早期阶段，其中原发肿瘤和肝转移同时存在。标准治疗通常结合全身化疗和手术切除，但5年生存率仅约为50%，且临床结果和对治疗的反应存在显著的异质性。患者的临床变异性不仅可能源于肿瘤固有的变化，还可能来自TME中的免疫改变。在这一背景下，TAM可能通过多种机制显著加速肿瘤的进展、侵袭和扩散。TAM的临床相关性已在多种癌症类型中被报道，包括结直肠癌。最近，我们识别出一种独特的TAM亚型，称为大TAM，它们的形态和转录组特征在CRLM患者中更为显著，且与最差的预后相关。然而，我们仍然不清楚这种大TAM亚群的富集是否是CRLM TME的特殊现象，还是也存在于匹配的原发肿瘤TME中。此外，对大TAM的单细胞层面的表征仍是一个重要的知识空白，因为CRLM患者的复发率显著高于原发结直肠癌患者。

本研究中，我们对三名同时接受原发肿瘤和肝转移瘤手术切除的患者进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，以深入了解早期同步性CRLM中TAM的转录异质性和差异。我们的研究结果揭示了结直肠癌和肝转移瘤TME中炎症性和免疫调节性TAM的逆向比例关系，以及两个组织中TAM的异质性。此外，我们还发现，结直肠癌相关的炎症性TAM表达了抑制性配体，这些配体可能支持免疫逃逸，从而促进肝转移的发生。而CRLM病变则表现出高度的免疫抑制性微环境，其特征是存在大量增殖的CTLA4+免疫调节性TAM和细胞毒性IL7R+ TAM。这些特定的TAM亚群频率较高与较差的疾病无进展生存期和更差的患者预后相关。

在材料和方法部分，我们详细描述了研究的伦理批准和患者信息。所有参与研究的患者（n=18）均被组织学确认为具有同步性CRLM，并接受了原发性结直肠肿瘤和肝转移瘤的同步手术切除。患者提供了书面知情同意，用于组织收集和生物库的建立。研究遵循《赫尔辛基宣言》（1975）的伦理原则，并获得了IRCCS Humanitas研究医院伦理委员会的批准（协议号282/19）。研究未考虑KRAS突变状态。

为了进行单细胞分析，我们收集了结直肠癌和肝转移瘤的周围组织样本，并将其与外周血单个核细胞（PBMC）进行比较。我们采用单细胞RNA测序技术对这些样本进行了高通量分析，以揭示TAM的转录组特征。我们还使用了公开的健康肝脏和健康血液的scRNA-seq数据库，以进一步分析TAM的转录组特征和功能差异。

通过分析差异表达基因（DEG），我们发现TAM在结直肠癌和肝转移瘤中具有不同的转录特征。例如，在结直肠癌中，炎症性TAM主要表达与趋化信号响应和迁移至炎症部位相关的特定基因，而免疫调节性TAM则表现出支持抗炎功能和组织重塑的特性。此外，我们还计算了基因模块得分和细胞周期得分，以评估不同TAM亚群的基因表达模式和细胞周期状态。通过伪时间分析，我们追踪了TAM在不同组织中的分化轨迹，揭示了它们在结直肠癌和肝转移瘤中的动态变化。

在结果部分，我们发现结直肠癌和肝转移瘤中的TAM表现出显著的异质性。例如，结直肠癌中的炎症性TAM主要表达S100基因家族（如S100A8、S100A9和S100A12）和多种促炎基因（如CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL4L2、CXCL8和CXCL10），这些基因参与炎症信号传导和促炎细胞因子的产生。而肝转移瘤中的免疫调节性TAM则表现出较高的HLA和C1q基因表达，这些基因与免疫调节和组织重塑相关。此外，我们还发现，肝转移瘤中的TAM具有独特的转录组特征，例如表达IL7R、TIGIT、CD96和ICOS等免疫检查点基因，这些基因在淋巴细胞中已被报道具有抑制功能。

通过整合转录组数据，我们进一步揭示了结直肠癌和肝转移瘤中TAM的组织特异性动态。例如，结直肠癌中的炎症性TAM主要表达S100A8、S100A9和VCAN等基因，而肝转移瘤中的免疫调节性TAM则主要表达CD163、MRC1和C1QA–C等基因。此外，我们还发现，肝转移瘤中的TAM表现出增殖特性，这与它们的细胞周期状态密切相关。通过伪时间分析，我们发现这些增殖性TAM在肝转移瘤中的分化路径与血液中的经典单核细胞相似，但它们的表达模式和功能特征在肝转移瘤中更为显著。

讨论部分强调了TAM在CRLM中的关键作用。TAM在肿瘤微环境中表现出高度的异质性，其功能特性可能影响患者的预后。例如，结直肠癌中的炎症性TAM可能通过表达抑制性免疫检查点配体（如PD-L1和NECTIN2）支持免疫逃逸，而肝转移瘤中的免疫调节性TAM则通过高表达CTLA-4和TIM-3等基因促进免疫抑制。这些发现为开发针对CRLM的免疫治疗策略提供了新的思路，例如通过调节TAM的极化状态来增强抗癌免疫反应。

本研究的结论表明，TAM的组织特异性转录组特征在CRLM的早期阶段对肿瘤的进展和转移具有重要影响。结直肠癌和肝转移瘤中的TAM比例差异可能解释了这两种组织中肿瘤进展的不同机制。此外，肝转移瘤中的增殖性TAM可能具有独特的功能特征，这为未来的临床研究提供了新的方向。研究还指出，通过阻断TAM向免疫抑制性表型的转化，无论是单独使用还是与化疗联合使用，都可能显著增强抗癌免疫反应，从而改善CRLM患者的治疗结果。

总之，本研究通过单细胞转录组分析揭示了CRLM中TAM的异质性和功能特征，强调了TAM在肿瘤进展和转移中的复杂作用。这些发现为理解CRLM的病理生理机制提供了重要的线索，并为开发新的免疫治疗策略奠定了基础。未来的研究需要进一步验证这些发现，并探索如何利用这些信息来优化CRLM的治疗方案。