质子微束放疗对胶质母细胞瘤大鼠模型抗肿瘤免疫反应的评估

《Cancer Immunology Research》：Evaluation of Proton Minibeam Radiotherapy on Antitumor Immune Responses in a Rat Model of Glioblastoma Open Access

　　

治疗放射抵抗性肿瘤如多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme）仍是一个挑战，其免疫抑制特性加剧了这一难题。放疗（radiotherapy，RT）发挥免疫调节作用，同时具有免疫抑制和免疫刺激效应。这些效应的性质取决于总剂量、分次剂量、剂量递送方式和治疗时长。大分割放疗（hypofractionation）被认为可向免疫刺激方向倾斜。然而，在体积较大的肿瘤如胶质瘤中，大分割放疗的使用受到限制，因其毒性风险较高。因此，寻找在减少正常组织毒性的同时产生更有利免疫反应的新策略，可改善癌症治疗。在本研究中，研究人员评估了抗肿瘤免疫反应对质子微束放疗（proton minibeam RT，pMBRT）的应答。其免疫调节效应尚未完全明确。为探索这一问题，研究人员在胶质母细胞瘤临床前原位大鼠模型中对pMBRT治疗性剂量的免疫反应进行了深入表征。研究结果揭示了pMBRT与免疫反应之间的紧密关联。pMBRT比常规质子治疗更有效地增加了肿瘤中的淋巴细胞密度。单细胞转录组学（single-cell transcriptomics）鉴定了pMBRT后肿瘤免疫细胞中的多种免疫细胞类型和独特的转录变化，包括抗体产生增加、趋化性细胞因子表达和干扰素（IFN）反应。这些结果强调了适应性免疫，特别是T细胞，在pMBRT机制中的关键作用。pMBRT在单次放疗（RT）中即可触发抗肿瘤免疫反应，且对健康组织损伤最小，使其成为未来临床试验和放射免疫联合治疗的有前景的候选方案。

论文解读文章

**研究背景与问题**

多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是致死率最高的人类癌症之一，目前标准治疗方案（手术联合放疗及替莫唑胺化疗）仅能适度改善患者生存，且常导致神经后遗症。放疗（radiotherapy，RT）在肿瘤治疗中具有重要免疫调节作用，但常规放疗可能引起辐射诱导的淋巴细胞减少和免疫抑制。大分割放疗虽能偏向免疫刺激，但在体积较大的肿瘤如胶质瘤中因高毒性风险而受限。因此，需要探索既能降低正常组织毒性又能诱导更有利抗肿瘤免疫反应的新策略。空间分割放疗技术如格子放疗（lattice RT）或栅格放疗（GRID RT）已显示显著免疫激活和远隔效应。质子微束放疗（proton minibeam radiotherapy，pMBRT）结合了亚毫米空间分割的低毒性与质子治疗（proton therapy，PT）的物理优势，可减少淋巴细胞减少症和脑坏死等副作用，并在胶质母细胞瘤大鼠模型中维持或增强肿瘤控制。然而，pMBRT的免疫调节机制尚未完全阐明。本研究旨在填补这一空白，全面评估pMBRT在GBM中单次治疗性剂量后所引发的免疫反应，特别关注T细胞应答。

**研究内容与结论**

研究人员采用RG2-Luc-GFP细胞系原位接种于免疫健全Fischer 344（F344）大鼠和T细胞缺陷的Fischer Nude大鼠，构建GBM临床前模型，比较单次30 Gy平均剂量的pMBRT与常规质子治疗（conventional proton therapy，conv-PT）的抗肿瘤效果及免疫反应。通过流式细胞术、多重免疫荧光染色和单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）对肿瘤浸润免疫细胞进行定量、空间定位和转录组分析。主要结论包括：pMBRT的抗肿瘤效应依赖T细胞，在免疫健全大鼠中显著提高生存率，而在Nude大鼠中无效；pMBRT比conv-PT更有效地增加肿瘤中淋巴细胞密度，特别是组织驻留记忆CD8⁺ T细胞（tissue-resident memory CD8⁺ T cells）、B细胞和1型常规树突状细胞（conventional dendritic cells type 1，cDC1）；pMBRT能更有效地将CD4⁺和CD8⁺ T细胞吸引至肿瘤核心，而conv-PT仅增加肿瘤边缘和周边区域的T细胞；单细胞转录组学揭示pMBRT诱导了独特的转录变化，包括激活的树突状细胞中抗原呈递和T细胞共刺激分子上调、B细胞中抗体分泌相关基因上调、单核/巨噬细胞中热休克蛋白（HSP）和IFN信号通路基因上调，以及T细胞中IFN反应增强和耗竭标志物减少。这些结果表明pMBRT通过激活适应性免疫，特别是T细胞，发挥抗肿瘤作用，且对健康组织损伤极小。

**重要意义**

该研究首次全面揭示了pMBRT的免疫机制，证明其能在单次放疗中触发抗肿瘤免疫反应，为空间分割放疗的临床应用提供了重要理论基础。论文发表在《Cancer Immunology Research》。

**主要关键技术方法**

研究人员使用RG2-Luc-GFP细胞（来自ATCC）原位接种于6周龄F344大鼠（免疫健全）和Fischer Nude大鼠（T细胞缺陷），14天后进行单次30 Gy平均剂量的pMBRT或conv-PT照射（质子能量100 MeV，pMBRT使用65 mm厚发散黄铜多缝准直器形成平面微束）。通过流式细胞术分析肿瘤免疫细胞密度（照射后7天），多重免疫荧光染色分析免疫细胞空间分布（肿瘤中心、边缘、周边），单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析CD45⁺免疫细胞转录组（使用10x Genomics平台，Cell Ranger和Seurat处理）。另使用F98细胞模型进行验证。样本来源包括RG2和F98两种大鼠胶质瘤模型。

**研究结果**

**pMBRT依赖T细胞的作用**：通过比较WT F344大鼠和Nude大鼠的生存曲线，发现pMBRT在免疫健全大鼠中显著提高生存率（P=0.0001），而在Nude大鼠中无差异，表明pMBRT的抗肿瘤效应依赖于T细胞功能。

**pMBRT在肿瘤微环境中引发强烈免疫反应**：流式细胞术结果显示，pMBRT显著增加肿瘤中CD4⁺ T细胞（包括常规和调节性T细胞）、CD8⁺组织驻留记忆T细胞、B细胞和cDC1的密度，而conv-PT仅增加CD4⁺ T细胞和CD43⁺单核细胞。细胞因子分析显示，两种照射均增加IL1β、CXCL1和TNFα，但仅conv-PT在照射后24小时出现急性IL6升高。

**pMBRT诱导淋巴细胞更高效地趋化至肿瘤核心**：多重免疫荧光染色显示，pMBRT显著增加肿瘤核心区域的CD4⁺和CD8⁺ T细胞密度，而conv-PT仅增加边缘和周边区域。pMBRT还增加肿瘤边缘和周边的B细胞密度。两种照射均增加肿瘤核心的巨噬细胞和CD8⁺巨噬细胞。

**大鼠GBM浸润免疫细胞的单细胞转录组学分析**：scRNA-seq共获得14,025个（对照）、13,135个（conv-PT）和14,807个（pMBRT）肿瘤免疫细胞，鉴定出18个细胞亚群，包括中性粒细胞、树突状细胞（DC）、单核/巨噬细胞、T/NK细胞和B细胞。

**pMBRT在不同免疫细胞群体中诱导的转录变化**：差异表达基因分析显示，pMBRT激活的DC（C3）显著上调抗原呈递和T细胞共刺激基因（如Cxcl10、RT1-Bb、Cd80、Cd86）；B细胞（C18）上调抗体分泌相关基因（如Jchain、Mzb1、Xbp1）；单核细胞（C6）和单核/巨噬细胞（C7）上调HSP家族、IFN信号通路（如Irf1、Irf7）和趋化因子Cxcl11。pMBRT还上调单核细胞中促炎基因Clec10a和髓系分化基因。

**pMBRT诱导的T细胞分析**：T细胞亚群再聚类鉴定出10种淋巴细胞亚型，包括CD8⁺终末分化效应记忆T细胞（TEMRA）、IFN反应T细胞等。pMBRT诱导的T细胞中IFN反应基因（如Irf7、Isg15、Ifitm1）和IFNγ表达增加，而conv-PT诱导的T细胞中耗竭标志物（Tigit、Tox）和CTLA-4上调。CellChat分析显示pMBRT增强CXCL10-CXCR3和CXCL11-CXCR3配体-受体相互作用，促进T细胞趋化。

**总结与讨论**

本研究结果表明，pMBRT通过增强适应性免疫，特别是T细胞，显著提升抗GBM免疫反应，增加淋巴细胞密度并改变转录组。机制可能涉及pMBRT对血管结构的更好保护、免疫原性细胞死亡事件、IFN-I信号通路上调及趋化因子CXCL10的独特表达。与conv-PT相比，pMBRT诱导的T细胞更少耗竭、更多激活。研究局限性包括比较方案的公平性、模型免疫原性及结果需在人临床试验中验证。研究结论：pMBRT在单次放疗中即可触发抗肿瘤免疫反应，且对健康组织损伤极小，有望成为未来临床试验和放射免疫联合治疗的有前景候选方案。该研究为空间分割放疗与免疫治疗的结合提供了重要依据。