综述：结核分枝杆菌荧光和生物发光成像技术：解决灵敏度问题

《Expert Review of Respiratory Medicine》：Mycobacterium tuberculosis fluorescent and bioluminescent imaging technologies: addressing the issue of sensitivity

本综述系统探讨了结核病诊断与研究中光学成像技术（尤其是荧光与生物发光）的应用与挑战，重点介绍了报告酶荧光（REF）这一新兴高灵敏度技术，其利用结核分枝杆菌（Mtb）特有的BlaC酶与特异性探针结合，可将检测阈值降至10–100个细菌，为新型疗法、疫苗研发及快速诊断（特别是儿科结核）提供了变革性工具。

　　

引言

结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mtb）引起的古老传染病，至今仍是全球主要致死性传染病之一。Mtb生长缓慢（约20小时），给研究和诊断带来巨大挑战。快速、灵敏地量化细菌载量的成像技术对新疗法和疫苗的研发以及实现快速诊断具有深远影响。

灵敏成像策略

非侵入性全身成像技术对于理解发病机制、评估新药至关重要。其主要配置包括表皮照明（光源与探测器在同侧）和透射照明（光源与探测器在异侧），后者能减少皮肤自发荧光，采样更准确。活体成像系统（IVIS）是常用平台。近年来，微内窥镜（光纤束）技术的发展通过将光源直接送入肺部等黏膜组织，显著提高了深层组织内光学靶标的检测灵敏度，降低了检测阈值。

荧光成像

荧光技术是检测Mtb的强大工具。传统荧光显微镜需处死动物，而基于重组基因或荧光探针的荧光成像技术则能进行实时活体监测。波长优化是关键，近红外荧光探针（如tdTomato）因其组织穿透能力强、散射少，比绿色荧光蛋白（GFP）等短波长探针更适用于活体，检测阈值可达10³-10⁴菌落形成单位（CFU）。结合光纤束进行腔内照明和信号收集，可进一步将肺部检测阈值提升至10³ CFU。

生物发光成像

生物发光基于酶促反应（如荧光素酶催化荧光素），背景信号极低，是细胞活力的良好指标。在Mtb中，主要应用了点击甲虫红色荧光素酶（CBRlux）和萤火虫荧光素酶（FFlux）。其检测阈值在小鼠体内约为10³-10⁴ CFU。由于这两种荧光素酶的发光波长不同，它们可用于混合感染研究，在同一动物体内追踪野生型与突变菌株。

报告酶荧光（REF）

REF是一种高灵敏度Mtb成像技术，其利用Mtb固有且持续表达的BlaC（一种A类β-内酰胺酶）。BlaC具有独特的活性位点，对Mtb高度特异。REF使用针对BlaC设计的氟源性或生物发光探针（如CDC-OMe, CDG-OMe, CDG3）。这些探针被BlaC切割后产生荧光或释放荧光素，从而产生信号。REF技术无需构建重组菌株，检测阈值极低，在体外可在10分钟内检测到10个细菌，在体内可检测10–100个细菌，远超传统方法。

用于快速诊断的氟源探针

针对床旁诊断，已开发出CDG3等高性能探针。其对BlaC的催化效率比其他β-内酰胺酶（如TEM-1）高120,000倍，在痰液中可检测低至10 CFU的Mtb，灵敏度与培养法相当甚至更优。该技术符合ASSURED标准（经济、灵敏、特异、用户友好、快速、稳健、设备要求低、可及），极具应用前景。

用于活体成像的探针

为活体应用设计的近红外REF探针（如CNIR5, CNIR800）采用荧光共振能量转移（FRET）原理，酶切后使淬灭剂与荧光团分离，产生近红外荧光。CNIR800（激发/发射峰：745/795 nm）的组织穿透性最佳，可在感染后5-7小时达到信号峰值，检测阈值达10²-10³ CFU，比CNIR5更灵敏、更快。

灵敏度提升与未来方向

通过结合长波长探针、光纤束腔内照明/检测、以及改进的重组报告系统，成像灵敏度有望进一步提升至检测单个细菌的水平。未来方向包括开发更特异、更灵敏的探针，将REF与光纤束系统转化为临床实用的诊断工具，以及构建稳定的染色体整合型双报告系统用于临床前研究。

结论

光学成像（荧光/生物发光）是追踪病原体、评估治疗方案和疫苗效力的宝贵工具。REF技术凭借其高灵敏度和特异性，在Mtb诊断和基础研究中展现出巨大潜力。尽管在活体检测灵敏度方面仍面临挑战，但技术的持续创新有望最终实现对单个细菌的检测，从而彻底改变结核病的研究和诊疗格局。