综述：更好地理解植物相关细菌胞外囊泡的生态作用

《Applied and Environmental Microbiology》：Toward a better understanding of the ecological roles of extracellular vesicles from plant-associated bacteria

本综述系统阐述植物相关细菌胞外囊泡（EVs）作为植物-细菌互作关键介质的最新进展，重点聚焦其在营养获取（PCWDEs）、致病性（T3SS效应因子）、免疫调节（MAMPs、SAR）、跨界RNA干扰（sRNAs、RNAi）及微生物群落通讯（QS、HGT）中的核心生态功能，为开发基于EVs的绿色农业策略（One Health）提供了创新视角。

　　

ABSTRACT

植物相关细菌（phytobacteria）释放的胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是植物-细菌相互作用中新兴的关键生态参与者。这些脂质纳米颗粒（约50-400 nm）能够递送毒力因子和细胞壁降解酶，促进宿主定殖。同时，EVs通过运输可诱导或抑制植物防御反应的化合物来调节植物免疫力。此外，它们还介导种间和跨界通讯，影响微生物群落动态。本综述强调了细菌EVs在植物-细菌对话多个环节中的参与，并强调需要深入研究植物细菌EVs，以更好地理解植物-细菌相互作用及其在“一体健康”（One Health）背景下的潜在应用。

INTRODUCTION

植物在整个生命周期中与栖息于其表面（如根、叶）或组织内的众多微生物持续互动。这些相互作用通过微生物之间及其与宿主之间各种分子的动态交换来介导，对植物健康产生从有益到有害的广泛影响。细菌分子的释放通常通过细胞膜扩散或分泌系统进行，后者用于分泌到胞外环境或直接注入邻近细胞质。细菌胞外囊泡（EVs）作为一种替代经典分泌系统的途径日益受到重视。这些脂质生物纳米颗粒允许细胞输出异质性的分子货物，参与长程分子相互作用，从而扩展微生物的作用范围。尽管其产生耗能，但细菌EVs能保护其货物免受在种内、种间或跨界相互作用中遇到的胞外威胁。

根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）发布的《细胞外囊泡研究最低信息要求（MISEV）》指南，本文将植物细菌研究中描述的所有类型胞外囊泡统称为EVs。在革兰氏阴性菌中，研究最多的是外膜囊泡（OMVs），它起源于外膜，主要携带周质成分。此外还有内外膜囊泡（OIMVs）以及由前噬菌体衍生的内溶素诱导爆炸性细胞裂解形成的爆炸性OMVs（EOMVs）和爆炸性OIMVs（EOIMVs）。革兰氏阳性菌的膜囊泡则指源自细胞膜的单层囊泡。本综述不讨论革兰氏阳性菌EVs，因目前相关知识匮乏，且尚未描述其介导植物相互作用的例子。

尽管目前对细菌EVs在植物-细菌相互作用中的重要性的描述不及动物-病原体相互作用，但它们已被确定为越来越多植物-细菌相互作用中的关键因子。许多从细菌角度进行的研究表明，EVs可能参与递送感兴趣的化合物，如毒力因子或植物防御激发子。然而，尽管这些令人兴奋的发现为未来更好地理解植物-细菌相互作用的分子决定因素提供了可能，但植物细菌EVs的生态作用仅在少数模型系统中有所描述。当前假设基本上是从其他生态系统微生物相互作用积累的知识转化而来。因此，表征植物相关微生物EVs可能的生态作用对于更好地理解植物-微生物相互作用及其在更环保农业方法中的潜在应用至关重要。

本综述综合了过去二十年植物相关细菌EVs研究的关键进展，从生态学角度将植物细菌EVs的分子和功能相关性与植物健康联系起来，并总结了未来的研究方向和应用前景。

PLANT CELL WALL DEGRADATION AND NUTRIENT ACQUISITION

许多植物细菌，特别是定殖于质外体或细胞间隙的植物病原菌，会释放称为植物细胞壁降解酶（PCWDEs）的专用酶。这些酶被释放到胞外环境中，用于降解植物细胞壁屏障，以实现其在宿主体内的致病性或营养获取。使用EVs可以通过在细菌入侵前递送富含酶的货物来增强这一过程。多项研究在植物病原菌（如^{Pectobacterium brasiliense}、^{Pectobacterium zantedeschiae}、^{Xanthomonas campestris} pv. vesicatoria 和 ^{Xylella fastidiosa}）的EVs蛋白质组中鉴定出多种果胶降解酶、木聚糖酶和PCWDE-like酶，这些酶在体外和体内均保持功能活性。

植物细胞壁可通过木质化进行修饰。植物根际促生菌（PGPB）^{Pseudomonas putida} 在其生长环境中存在木质素衍生芳香化合物（如羟基肉桂酸，HCAs）时，会分泌携带能够降解这些化合物的酶的EVs。有趣的是，HCAs及其降解产物已知在植物防御中发挥作用，因为它们可能对微生物有害。细菌可能利用其EVs作为工具来响应植物防御反应，从而解毒其环境。在PGPB ^Azospirillum sp. B510的EVs中也发现了HCA降解酶。由于已知该细菌能诱导植物产生HCAs，它可能利用其EVs响应植物代谢变化，为自身营养服务。

此外，植物细菌EVs被发现携带多种底物结合受体，这些受体可以是非特异性的（如普通糖受体），也可以更特异地针对植物化合物（如腐胺结合受体）。而且，EVs通常含有许多参与铁载体获取的蛋白质。在^{Xanthomonas citri}中，EVs被证明可以运输铁，可能是通过TonB依赖性受体结合的铁载体。

因此，EVs可能代表植物细菌在远离细胞处获取资源的一种策略。提出了两种非互斥的假说来支持EVs在此类营养获取中的作用。第一种假说认为，EVs可将其货物释放到周围环境中，让可溶性分解代谢酶降解营养物质，降解产物随后由细胞直接从胞外环境摄取。另一种假说认为，胞外底物可被内化到EVs中，由位于其内的分解代谢酶降解，随后EVs回泊至细菌细胞，将降解产物释放到周质空间。如果EVs特异性地泊定到属于其物种的个体，这种假说可能为微生物在营养竞争中提供明显优势。这一想法得到了事实的加强：在^{Agrobacterium fabrum}的EVs中发现的脂蛋白Atu8019可以驱动蛋白脂质体和EVs特异性地泊定到自身及其亲缘关系较近的细菌物种。然而，关于此类EVs作用如何与细胞营养摄取相关联的直接证据仍然有限，需要进一步研究。

VIRULENCE AND PATHOGENICITY

对植物病原细菌EVs的研究揭示了其他毒力因子的存在，这些因子可能帮助其在宿主定殖过程中发挥作用，类似于哺乳动物病原体中已描述的情况。例如，在植物病原菌^{Pseudomonas syringae}的EVs中发现了III型分泌系统（T3SS）的毒力效应因子，包括HopI1、HopM1和HopE1等，这些效应因子已知通过干扰细胞机制来抑制^{Arabidopsis thaliana}的植物防御。

有趣的是，细菌EVs似乎是传统分泌系统的替代途径，因此被提议为0型分泌系统。它们为通常由II型分泌系统（T2SS）分泌的PCWDEs提供了另一条分泌途径。此外，它们还允许运输通常由植物病原菌利用T3SS直接注入真核宿主细胞的毒力效应因子，如在^{P. syringae}中所见。而且，^{X. fastidiosa}的EVs含有毒力因子，如LesA脂肪酶，与^{X. oryzae}中通过T3SS运输的效应因子同源。由于^{X. fastidiosa}在其致病武器库中不拥有T3SS，EVs可能被细菌用作毒力因子分泌的替代策略。

此外，植物细菌EVs可能不是通过其货物含量，而是通过EVs与宿主细胞之间的物理相互作用来促进毒力。事实上，^{X. fastidiosa}的EVs已被证明可以减少细菌对木质部导管壁的粘附，从而促进细菌在植物体内的群游和运动。

关于植物相关微生物的EVs，迄今为止，大多数研究都集中在相同的、已有充分描述的植物病原模型上。然而，许多植物病原菌采用涉及多种毒力效应因子的独特感染策略。此外，许多植物有益细菌也利用效应因子来定殖宿主。因此，研究更广泛的细菌模型应能提供更多关于EVs在植物定殖过程中作用的见解，并有助于识别细菌EVs携带的关键毒力因子。

PLANT IMMUNE MODULATION

虽然植物相关细菌的EVs可能通过递送功能性货物促进宿主定殖，但它们也运输可被植物识别的细菌物质，从而调节其免疫反应。具体而言，微生物相关分子模式（MAMPs）可被位于植物细胞膜表面的多种模式识别受体（PRRs）识别。在植物中，MAMPs被PRRs识别有时会导致过敏反应（HR）的建立，其特征是活性氧（ROS）积累以及随后因细胞凋亡在感染部位出现坏死。这第一道防线使植物能够限制病原体通过细胞传播。例如，来自^{P. brasiliensis}、^{P. syringae}和^{X. campestris}的EVs已被证明可运输毒力效应因子，并在^{Nicotiana benthamiana}、^{Solanum lycopersicum}和^{A. thaliana}中诱导HR。

相反，来自许多植物细菌的EVs运输过氧化氢酶或超氧化物歧化酶，这些酶可能帮助细菌在植物感染过程中克服HR。例如，在^{P. syringae}中，过氧化氢酶KatB在EVs中被发现并保持其酶活性。而且，在ROS存在下，EVs的分泌和KatB的积累都会增加。

除了诱导局部HR外，植物细菌EVs还可以作为免疫激活因子，在植物中引发系统免疫。事实上，HR并非总是在微生物感染的早期阶段触发，而系统获得性抗性（SAR）总是在植物检测到微生物后诱导产生。这种防御系统受信号分子在感染点水杨酸（SA）或茉莉酸（JA）积累后的系统扩散所调节。这些信号分子通过诱导植物细胞壁强化和激活参与次生代谢物及抗菌化合物生物合成的代谢途径来刺激宿主防御反应。SAR提供了扩展的宿主保护，并且其建立与微生物的致病性无关。与它们来源的微生物类似地作用于植物，细菌EVs可以诱导植物宿主的SAR。例如，在^{A. thaliana}中，来自植物病原菌^{X. campestris} pv. campestris、^{X. oryzae} pv. oryzae 和 ^{P. syringae} pv. tomato 的EVs诱导了SAR相关基因的表达。

确认这些分子层面的见解，四项不同的研究证明，用来自病原物种（^{P. syringae}、^{X. campestris}）或有益物种（^{P. fluorescens}）的EVs预处理^{A. thaliana}叶片，均能抑制病原菌感染。所有这些研究都将EVs对^{A. thaliana}的影响与纯化MAMPs的影响进行了比较，试图找出解释EVs作用的单一因素。共同的结论是，免疫激发活性不能归因于单一的MAMP，植物对植物细菌EVs的反应是复杂的。值得注意的是，^{X. campestris}的EVs能够以不依赖MAMP的途径诱导植物免疫反应，并可能依赖于植物细胞膜因^{X. campestris} EVs膜中存在的某些类别脂质的插入而发生的生物物理变化。这些结果为关于细菌EVs与植物相互作用提供了新的视角，并强调需要考虑EVs蛋白质含量之外的分子参与者。

CROSS-KINGDOM RNA INTERFERENCE

细菌EVs现在已知也携带核酸，包括双链DNA、mRNA和小调节RNA（sRNAs），这些核酸可以影响宿主基因表达。最近，几项研究特别关注表征植物细菌的sRNA含量，因为它们在通过RNA干扰（RNAi）进行跨界通讯中的明显作用。这一过程可能导致特定宿主基因的沉默，特别是那些参与免疫的基因。这种机制在概念上类似于宿主诱导的基因沉默（HIGS），即植物产生的sRNA触发目标植物病原菌中的基因沉默。在这两种情况下，植物的RNA沉默 machinery，包括Dicer-like（DCL）和Argonaute（AGO）蛋白，在处理和引导sRNAs到达其目标方面起着关键作用。直到最近，细菌sRNAs如何被转移到植物细胞仍是一个悬而未决的问题。与蛋白质不同，sRNAs缺乏专用的输出途径。然而，发现EVs含有sRNA货物并保护它们在胞外环境中免于降解，导致了对它们表征的兴趣日益增加。

两项最近的功能性研究阐述了植物细菌EVs中sRNA的作用，特别是在调节宿主免疫反应方面。一方面，RNA-seq分析允许鉴定植物病原菌^{X. oryzae} pv. oryzicola 产生的EVs中差异包装的sRNAs。其中，Xosr001在EVs接种后在宿主植物细胞中被发现，它靶向^OsJMT1转录本，从而减少茉莉酸甲酯（MeJA）的积累，并减弱水稻叶片中JA介导的防御反应。另一方面，^{X. fastidiosa}产生含有核酸的EVs，这些核酸参与细菌和植物细胞中的基因表达调控（关于RNA货物），并可能参与基因组岛（GIs）的水平基因转移（HGT）。有趣的是，在^{X. fastidiosa} EVs中检测到的一些sRNAs的靶标在接种纯化EVs后下调，支持了它们参与跨界RNAi。此外，蛋白质组学分析允许鉴定在细菌EVs中富集的RNA结合蛋白（RBPs），包括RNA伴侣蛋白Hfq。这与许多sRNAs需要Hfq或其他RBPs来保持稳定性和靶标识别的事实一致。总之，这些观点强调需要对植物细菌EVs中sRNA含量进行更深入的功能和机制理解。

COMMUNICATION WITHIN MICROBIAL COMMUNITIES AND HORIZONTAL GENE TRANSFER

在植物环境中，植物细菌通过种内或种间交换与不同植物区室（即叶圈和根圈）内的多种其他微生物相互作用。这些相互作用可以产生间接的有益效果，例如有益细菌抑制病原体，或者通过协调病原体感染而产生有害效果。细菌协调在宿主定殖中起着重要作用，许多细菌利用群体感应（QS）通讯来调节其定殖过程。属于扩散性信号因子（DSF）家族的QS信号分子在^{X. fastidiosa}的EVs中被发现，并参与其产生。这种运输可能有助于此类非极性分子在细菌环境中向受体细胞扩散，从而在植物和昆虫定殖过程中使细菌受益。

细菌EVs也可能帮助细菌通过向共存威胁递送抗菌化合物来确保生态位的建立。例如，^{Rhizobium etli}的EVs被证明对^{Bacillus subtilis}具有抗菌活性，可能是由于肽聚糖修饰酶的活性。此外，^{P. brasiliensis}的EVs被证明携带VI型分泌系统（T6SS）毒素，在体外抑制^{Dickeya dadantii}的生长。与T2SS和T3SS一样，细菌EVs似乎是T6SS的替代品，这可能允许长距离的细菌战。植物细菌的EVs也可能在细菌防御在植物环境中产生抗生素的真菌中发挥作用。事实上，携带β-内酰胺酶的^{Pectobacterium} spp. 的EVs被证明可以保护敏感的大肠杆菌免受氨苄青霉素的影响。这可能是一种普遍机制，因为在其他著名细菌模型如^{Staphylococcus aureus}和^{E. coli}中也发现了这一点。

在微生物群落内部，种内和种间通讯不仅限于化学化合物的交换。过去几年中，已经表明EVs也可以作为遗传物质转移的穿梭工具，递送“DNA编码的信息”，这些信息可能调节群落动态。核酸转移确实是细菌进化的关键驱动力，因此代表了遗传多样性和可塑性的真正来源。在此之前，细菌间HGT的主要机制仅限于自然转化、接合和转导。由EVs介导的第四种HGT机制的存在，称为“囊泡转导”（vesiduction），已被几项研究揭示。细菌遗传物质的转移在土壤生态系统和植物相关微生物群落中尤其重要。在根圈，高微生物密度、根相关生物膜上紧密的细胞接近度以及来自根系分泌物的重要碳通量促进了基因交换。在这种环境中，HGT已被证明通过强烈驱动病原菌和有益细菌中性状的交换来影响植物健康。然而，DNA被认为寿命短，因为会被DNase快速酶降解。DNA与EVs的结合，无论是在内部还是外部，因此可以显著增强DNA稳定性，从而增加遗传物质的持久性和可转移性。因此，探索植物细菌EVs中的DNA和囊泡转导对于更好地理解植物相关微生物群落中的遗传多样性和可塑性至关重要，这可能会显著影响植物健康以及微生物群落的组成和功能。这一观点在一项关于^{X. fastidiosa}的最新研究中显得尤为重要，该研究揭示了与EVs表面相关的DNA结合蛋白（DBP）和DNA的存在，其序列富含可能源自先前HGT的GIs。

最后，从跨界通讯的角度来看，EVs介导的从细菌到植物的遗传物质转移是一个尚未探索但非常引人入胜的问题。如前所述，^{A. fabrum}将细菌T-DNA跨界转移到植物细胞，在诱导植物病害中起关键作用。尽管通过IV型分泌系统（T4SS）的T-DNA转移已得到很好表征，但EVs在特定生态条件下将T-DNA转移给宿主植物的可能性仍有待阐明。

TO AN INTEGRATIVE ANALYSIS OF BACTERIAL EVs COMPOSITION

植物细菌EVs的货物是细胞间相互作用的关键载体，无论是与植物的跨界交换还是微生物群落内的种间通讯。大多数研究集中在从通用实验室培养基中提取的EVs含量上。然而，植物环境已被证明可以调节许多植物细菌的EVs货物。在植物模拟环境（即特定植物分子、植物渗出物）中生长的植物细菌的EVs货物可能富含有助于植物定殖的分子化合物（PCDWEs, MAMPs）。这些结果表明，使用通用实验室培养基进行细菌生长和EVs提取的体外研究可能产生不能反映体内条件的货物。从植物模拟生长培养基或甚至从植物环境（植物流体、根圈）中提取EVs将有助于更好地理解EVs在植物细菌生态学中的作用。

迄今为止，大多数关于植物细菌EVs的研究依赖蛋白质组学分析来研究其货物并解释其对植物的影响。虽然这种方法高度相关且灵敏度越来越高，但由于许多已知的MAMPs是蛋白质，它可能限制我们对EVs在植物-细菌相互作用中作用的整体理解。正如我们之前讨论的，脂质组学分析是另一种有前途的技术，因为脂质及其衍生物是EVs的常见组成部分。事实上，EVs的形成驱动了参与膜弯曲的特定脂质的选择性富集，从而改变了它们来源细胞的脂质相对丰度。这种脂质组成的差异迄今仅在三个植物细菌模型中得到证实：^{A. fabrum}、^{Pseudomonas chlororaphis} 和 ^{X. citri}。而且，已经证明细菌EVs与宿主细胞的融合依赖于EVs和细胞膜的脂质组成，突出了脂质在EVs介导的相互作用中的重要性。

除了脂质，LPS存在于革兰氏阴性菌EVs的表面，并参与细菌毒力和宿主免疫调节。有趣的是，由于细菌可以利用LPS调整来逃避宿主检测，携带此类LPS的EVs可能充当诱饵，允许细菌在细胞感染前引诱植物。在植物细菌中可能是这种情况，^{P. chlororaphis}、^{X. campestris} 和 ^{P. syringae} 的EVs显示出与细菌细胞不同的LPS谱。而且，LPS影响EVs的表面电荷和疏水性，从而影响它们与受体细胞融合的潜力。

细菌EVs也可以运输无法自由通过细菌膜扩散的分子。例如，^Paracoccus sp. 利用其EVs运输参与QS依赖性通讯的长链N-酰基高丝氨酸内酯。在植物细菌中，^{X. fastidiosa></sup}