染色质环境调控秀丽隐杆线虫紫外线损伤形成与核苷酸切除修复的动态图谱

《Nucleic Acids Research》：Chromatin context shapes DNA damage formation and nucleotide excision repair dynamics in Caenorhabditis elegans

本研究针对染色质环境和转录活性如何在全生物体尺度影响DNA损伤形成与修复这一未解之谜，在秀丽隐杆线虫中绘制了高分辨率、全基因组的紫外线诱导DNA损伤((6-4)光产物和环丁烷嘧啶二聚体)及其修复的动态图谱。研究发现，全局修复是主要修复途径，但转录偶联修复对(6-4)光产物的修复程度与环丁烷嘧啶二聚体相当，这在动物中尚属首次发现。修复效率（而非损伤形成的不均匀性）是残留损伤的主要决定因素，且修复信号在可及染色质区域呈现核小体大小的周期性。该研究确立了秀丽隐杆线虫作为研究染色质背景下损伤形成与修复的宝贵模型，并揭示了拓宽后生动物DNA修复机制理解的物种特异性特征。

　　

所有生物体，从细菌到人类，都必须维持基因组的完整性，并进化出修复DNA损伤的机制。核苷酸切除修复（NER）是关键途径之一，负责清除紫外线（UV）诱导的庞大损伤，如(6-4)光产物（(6-4)PPs）和环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）。在人类中，NER基因的突变会导致一系列症状，包括紫外线敏感性和癌症风险增加。尽管NER机制在进化上高度保守，但不同物种在双切口机制、紫外线光产物去除动力学以及转录偶联修复（TCR）的参与程度上存在显著差异。理解DNA损伤如何在细胞环境中形成和修复，其中DNA不断被转录、复制并包装成高级结构，仍然是一个未完全解决的重大问题。虽然损伤形成本身很大程度上由序列和其他化学性质决定，但先前研究表明NER的效率在不同染色质景观中差异很大。例如，庞大的DNA加合物在开放染色质区域（如活性启动子和强增强子）中修复得更快，而在抑制性或异染色质区域中修复速度明显减慢。此外，在酵母、人类和果蝇中的研究表明，DNA围绕核小体的旋转定位会导致~10 bp周期性的优先损伤形成。然而，核小体结构本身对修复构成了物理障碍，降低了切口效率和修复机器的可及性。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）自20世纪80年代以来就被用于研究核苷酸切除修复。哺乳动物修复机制的大多数核心组分在秀丽隐杆线虫中是保守的。然而，秀丽隐杆线虫中紫外线诱导的DNA损伤修复动力学与其他后生动物中观察到的不同。值得注意的是，CPDs和(6-4)PPs的修复效率相似，这与人类中(6-4)PPs比CPDs去除得快得多的情况不同。支持这一观察的是，最近对秀丽隐杆线虫紫外线诱导突变特征的分析表明，这些特征可能同时归因于CPDs和(6-4)PPs，这与它们相似的修复速率一致。此外，NER对秀丽隐杆线虫紫外线生存率的贡献是受发育调控的：全局基因组修复（GGR）在生殖细胞和胚胎中占主导地位，而转录偶联修复在幼虫和成虫阶段对生存变得更为关键。尽管从突变和生存研究中获得了这些见解，但对秀丽隐杆线虫DNA修复活性的直接分析在很大程度上仍未探索。

为了填补这一空白，研究人员利用秀丽隐杆线虫这一广泛用于研究DNA修复及相关过程的模式生物，开展了这项研究。本研究旨在全基因组范围内、高分辨率地揭示染色质环境和转录如何决定损伤和修复的时空模式。研究结果发表在《Nucleic Acids Research》上。

为开展此项研究，作者主要应用了以下几种关键技术方法：利用Damage-seq（损伤测序）和XR-seq（切除修复测序）分别绘制了L1期秀丽隐杆线虫在紫外线照射后不同时间点的(6-4)PP和CPD损伤及其修复的单核苷酸分辨率图谱；通过slot blot（斑点印迹）实验定量分析了野生型、csb-1（TCR缺陷）、xpc-1（GGR缺陷）和xpa-1（NER缺陷）品系中两种光产物的修复动力学；整合分析了公共数据库中的组蛋白修饰（H3K4me1, H3K4me3, H3K36me3, H3K27me3）和本研究生成的ATAC-seq（测定转座酶可及染色质测序）数据，以评估染色质环境对损伤和修复的影响；使用Boquila序列模拟器来校正序列组成偏差；并通过傅里叶分析定量评估了损伤和修复信号在核小体周期上的强度。

Capture and characterization of DNA damage-containing excised oligonucleotides from C. elegans

研究人员通过免疫沉淀捕获了线虫L1期幼虫在紫外线照射后不同时间点（5分钟、1小时、4小时）切除的、含有(6-4)PP或CPD损伤的寡核苷酸。凝胶电泳分析显示，最早的5分钟时间点捕获到的切除产物长度在16-30核苷酸（nt）之间，峰值在~24 nt。随时间的推移，产物长度变短，表明其在体内发生了降解。通过顺序抗体下拉策略，发现切除产物中(6-4)PP/CPD的比例在0.5到0.7之间。考虑到紫外线B（UVB）诱导CPD的频率比(6-4)PP高约8倍，这一比例表明(6-4)PP的切除频率比CPD高约4倍。随后，研究人员从照射后1小时捕获的切除寡核苷酸构建了XR-seq文库。对24 nt长的读段进行碱基组成分析，发现在(6-4)PP文库中，距读段3'端第6位点富集TC、CT和TT二核苷酸；在CPD文库中，则富集TT二核苷酸，这与在其他生物体中的研究一致，证实了损伤的特异性。

Transcription-coupled repair plays a significant role in the removal of both (6-4)PPs and CPDs in L1-stage C. elegans

XR-seq读段定位到基因组后，基因组浏览器视图显示，在转录区域的转录链（TS）上，(6-4)PP和CPD的修复读段均多于非转录链（NTS），这是TCR的典型特征。为评估损伤形成是否是修复链特异性的原因，研究人员在紫外线照射后立即进行了全基因组的Damage-seq。结果显示，两种损伤的Damage-seq信号相对均匀，表明链不对称性源于修复过程本身。对2142个选定基因的转录起始位点（TSS）和转录终止位点（TES）的荟萃分析进一步证实，两种损伤的修复信号在基因体内均显示出偏向TS的链偏倚。根据RNA-seq表达量将基因分层后分析发现，XR-seq显示两种损伤均存在强劲的转录依赖性修复，修复信号随着基因表达量的增加而增加，且在TS上更为显著。Damage-seq则显示TS与NTS的损伤水平仅有微小但显著的差异，且经序列模拟验证，这些差异主要归因于序列组成。这些发现共同证实，在秀丽隐杆线虫中，TCR不仅修复CPD，也显著参与(6-4)PP的修复。

Dominance of global repair revealed through repair kinetics and read distributions across the genomes of wild-type and repair-deficient strains

通过斑点印迹实验监测修复动力学发现，在野生型线虫中，(6-4)PPs和CPDs分别在24小时和36小时内被几乎完全清除。(6-4)PPs的修复速度快于CPDs。csb-1突变体的修复动力学与野生型几乎相同，表明TCR对整体切除活性的贡献很小。相比之下，xpc-1突变体表现出严重的修复缺陷，与xpa-1突变体相似，说明GGR是L1期线虫去除紫外线光产物的主要途径。对不同时间点XR-seq数据的层次聚类分析显示，xpc-1样本形成一个独立的簇，而野生型和csb-1样本聚集在一起。在xpc-1簇内，样本按时间点（早 vs. 晚）而非损伤类型分组，反映了在缺乏GGR的情况下，两种损伤都由TCR以相似的基因组分布进行修复。这些结果从修复动力学和全基因组分布两个层面一致表明，GGR在整体修复中占主导地位。

Transcription profoundly shapes excision repair dynamics in C. elegans

对野生型和修复缺陷型品系中链特异性Damage-seq和XR-seq信号随时间变化的分析表明，在野生型中，所有时间点均观察到修复的链偏倚。相应地，Damage-seq显示，在高度表达基因的TS上，紫外线照射后各时间点的残留损伤均显著低于初始损伤。在csb-1品系的XR-seq中，CPD在所有时间点的链偏倚均消失，符合其缺乏TCR的特征。对于(6-4)PP，在1小时和8小时时间点，链偏倚发生倒置，NTS的修复多于TS，提示在缺乏CSB因子时，停滞的RNA聚合酶II（RNAPII）对TS修复产生了转录抑制。在xpc-1品系中，修复几乎完全局限于TS，且TS修复随表达水平增加而增强。对TSS附近修复动态的分析发现，在野生型和xpc-1中，修复在1小时时于TSS附近出现一个TS修复峰，这可能反映了RNAPII从损伤位点解离并在TSS重新启动转录，从而促进了基因5'端的早期修复。而在csb-1中未观察到这种1小时的TS修复峰。对低表达基因的分析则显示，修复主要发生在较晚的时间点。这些发现凸显了转录水平对修复时序的深刻影响。

Chromatin context shapes both damage formation and the dynamics of excision repair in C. elegans

研究人员将损伤和修复图谱与组蛋白修饰（H3K4me1, H3K4me3, H3K36me3, H3K27me3）数据整合。基因组浏览器视图显示，在组蛋白活性标记（如H3K4me1）富集的区域，XR-seq修复信号增强，而在抑制性标记（如H3K27me3）富集区域，修复信号减弱。全基因组定量分析表明，尽管初始损伤在不同修饰水平的区域大致相似，但损伤的衰减模式显示，在高H3K4me1富集的活性区域残留损伤较少，而在强H3K27me3富集的抑制区域残留损伤较多。XR-seq则证明，在野生型和csb-1中，高H3K4me1富集区域修复较早，而强H3K27me3区域修复较晚。在xpc-1中，活性区域的修复在1小时达到峰值，而抑制区域在同一时间点的修复减少，这与在1小时观察到的TCR活性峰值一致。对以组蛋白ChIP-seq峰为中心的链特异性信号分析揭示了损伤形成和修复在峰中心及侧翼区域的非均匀分布。例如，(6-4)PPs在H3K4me1、H3K36me3和H3K27me3峰中心显示出明显的损伤形成峰。修复信号在野生型和csb-1中强烈富集于H3K4me1和H3K4me3峰中心，而在xpc-1中，修复在峰的一侧不对称富集，反映了转录的方向性。这些数据表明，染色质环境通过影响损伤易感性和修复效率双重作用，塑造了基因组完整性维护的格局。

Chromatin accessibility impacts damage formation and excision repair dynamics

对ATAC-seq峰中心的分析显示，Damage-seq信号在峰中心出现明显的凹陷，两侧信号增强，这种模式不能由序列偏差解释，提示DNA结合蛋白对损伤形成有抑制作用。修复信号则在早期时间点达到峰值，随后逐渐下降。在野生型和csb-1中，两种损伤的可及性最高（上四分位数）的ATAC-seq峰均表现出最强的修复活性。在xpc-1中，最强的四分位数分离出现在1小时，与最大TCR活性时间点相符。进一步分析发现，在高度可及的区域，Damage-seq和XR-seq信号均显示出明显的周期性模式，其波长与核小体重复长度（~160 bp）一致。Damage-seq信号的周期性随时间推移而变得更加明显，反映了 linker DNA 区域的优先修复，导致未被修复的损伤逐渐富集在核小体包裹的DNA上。XR-seq信号在野生型和csb-1的早期时间点也显示出强烈的~160 bp周期性，该周期性随时间逐渐减弱。在xpc-1中，周期性模式主要局限于峰中心的下游区域，表明TCR同样受到核小体占据的制约。傅里叶分析和信噪比（SNR）计算定量证实了这些周期性模式的存在和强度。

Nucleosome-centered repair periodicity differs between (6-4)PPs and CPDs

以核小体 dyad 为中心的分析揭示了更精细的~10 bp周期性，这与DNA环绕组蛋白核心的螺旋转折相关。Damage-seq图谱显示，在 dyad 周围，两种损伤均存在清晰的~10 bp周期性。未经校正的损伤信号在 minor groove 面向组蛋白表面（minor-in）的位置达到峰值，但经过序列模拟标准化后，损伤相对水平在 minor groove 面向外（minor-out）的位置更高，表明在考虑了序列背景后，损伤更易在 minor-out 位置形成。这种~10 bp的损伤周期性在所有时间点均持续存在。然而，修复的周期性模式在两种损伤间存在差异：CPD修复在原始RPKM值上显示出~10 bp周期性，但这种周期性在经过损伤水平标准化后消失，说明CPD修复本身是均匀的，其表观周期性源于损伤形成的周期性。相比之下，(6-4)PP修复无论是否标准化，均未显示出~10 bp周期性。研究人员推测，这可能是由于(6-4)PP引起更严重的DNA螺旋扭曲，可能导致核小体 repositioning 或部分解离，从而破坏了修复的周期性模式。

Discussion

本研究通过整合时间分辨的CPD和(6-4)PP损伤与修复图谱、染色质可及性及转录特征，揭示了在多细胞动物中，修复动力学和最终残留的DNA损伤更多地由染色质可及性和修复活性决定，而非损伤形成本身。TCR在清除(6-4)PP中的显著作用挑战了长期以来关于该损伤在动物中主要由GGR高效清除的假设。此外，观察到的修复周期性与核小体组织的联系强调了染色质结构对DNA损伤和修复动态的影响。研究发现，在秀丽隐杆线虫中，紫外线光产物通过距损伤位点5'端16 nt和3'端6 nt的双切口被切除，产生中位长度为24 nt的寡核苷酸，该产物随后会发生降解。与人类细胞相比，(6-4)PP在秀丽隐杆线虫中的修复速度较慢，这可能是其能够被TCR有效修复的原因之一。尽管GGR去除了大部分损伤，但完整的TCR对于确保在L1期（主要由非分裂体细胞组成）表达基因的功能持续至关重要，这与存活率研究结果一致。研究还发现，修复在启动子/增强子相关标记（H3K4me1, H3K4me3）区域发生较早且具有转录方向性，而在基因体H3K36me3区域修复延迟且TCR极性倒置，Polycomb抑制的H3K27me3区域则修复有限。核小体 positioning 对NER的抑制现象在秀丽隐杆线虫中得到证实，修复优先发生在 linker DNA 区域，导致损伤最终在核小体包裹的DNA上周期性富集，这可能与某些癌症（如皮肤黑色素瘤）中观察到的核小体周期性突变特征相关。在核小体 dyad 水平，损伤形成显示出与DNA minor groove 方向相关的~10 bp周期性，而修复过程本身（特别是对于CPD）是均匀的，其表观周期性是损伤分布的直接反映。(6-4)PP修复缺乏周期性则提示其可能引起核小体结构的局部扰动。总之，这些发现增进了我们对后生动物基因组维护机制的理解，并凸显了利用整体生物模型来阐明DNA修复时空协调性的价值。