NSUN6通过m5C修饰增强HMGB1表达促进创伤性脑损伤后神经元轴突再生

《Brain Research Bulletin》：NSUN6 promotes neuronal axon regeneration after traumatic brain injury by enhancing HMGB1 expression via m5C modification

本研究针对创伤性脑损伤（TBI）后轴突再生困难这一临床难题，首次揭示了RNA甲基转移酶NSUN6通过m5C修饰增强HMGB1 mRNA稳定性，进而促进神经元轴突再生的新机制。研究人员通过体内外TBI模型证实NSUN6过表达可显著改善神经功能缺损并上调GAP-43、βIII-tubulin等再生标志物表达，为TBI治疗提供了新的潜在靶点。

　　

当大脑遭受外力撞击导致创伤性脑损伤（TBI）时，神经元轴突的广泛损伤往往造成长期神经功能障碍。尽管轴突再生对于神经功能恢复至关重要，但成年哺乳动物中枢神经系统的再生能力极为有限。近年来研究发现，RNA表观遗传修饰在神经发育和损伤修复中扮演重要角色，其中5-甲基胞嘧啶（m⁵C）作为一种常见的RNA修饰，其功能在神经系统疾病中逐渐受到关注。然而，m⁵C修饰是否参与TBI后轴突再生的调控，至今尚不明确。

在这项发表于《Brain Research Bulletin》的研究中，福建医科大学附属第二医院神经外科团队聚焦于m⁵C甲基转移酶NSUN6，系统探讨了其在TBI后轴突再生中的作用机制。研究人员首先通过控制性皮质冲击（CCI）小鼠模型模拟临床TBI，发现损伤后NSUN6表达随时间推移逐渐升高，且与轴突再生标志物GAP-43的表达呈正相关。这一现象提示NSUN6可能参与TBI后的神经修复过程。

为深入探究NSUN6的功能，研究团队建立了原代皮层神经元牵张损伤模型，模拟TBI中的机械性损伤。通过基因操作技术（包括过表达和敲低NSUN6），他们发现NSUN6过表达可显著促进轴突再生，表现为GAP-43和βIII-tubulin表达上调以及轴突长度增加。相反，敲低NSUN6则抑制了这一过程。

机制探索方面，研究人员通过RNA测序发现高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是NSUN6调控的关键下游靶点。进一步实验证实，NSUN6通过增强HMGB1 mRNA的m⁵C修饰水平，提高其稳定性，从而促进HMGB1表达。双荧光素酶报告基因和RNA免疫共沉淀（RIP）实验均验证了NSUN6与HMGB1的直接相互作用。值得注意的是，敲低HMGB1可逆转NSUN6过表达带来的轴突再生促进作用，证明HMGB1是NSUN6发挥作用的关键介质。

在动物水平，NSUN6过表达显著改善了TBI小鼠的神经功能，表现为改良神经严重程度评分（mNSS）降低和平衡木测试成绩改善。同时，脑组织中轴突再生标志物表达也相应增加。这些结果一致表明，靶向NSUN6-HMGB1轴可能成为促进TBI后神经修复的新策略。

主要技术方法

本研究整合了多种实验技术：通过控制性皮质冲击建立小鼠TBI模型，原代皮层神经元牵张损伤模拟体外损伤；采用基因过表达/敲低技术调控NSUN6和HMGB1表达；通过甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）检测m⁵C修饰水平，RNA免疫共沉淀（RIP）验证蛋白-RNA相互作用；利用双荧光素酶报告系统分析转录活性；通过qPCR、Western blot、免疫组化/荧光评估基因表达和轴突再生；使用改良神经严重程度评分和平衡木测试进行神经功能评估。

3.1. Correlation analysis of NSUN6 expression and axonal regeneration after TBI

组织学分析显示TBI后脑组织出现进行性病理改变，NSUN6表达从损伤后6小时开始升高，72小时达到峰值。免疫组化显示轴突再生标志物GAP-43表达同步增加，相关性分析证实NSUN6水平与GAP-43阳性细胞比例呈正相关（r=0.09118）。

3.2. Neuronal survival is decreased after stretch injury

成功分离培养高纯度原代皮层神经元（MAP2阳性率>95%）。牵张损伤后，TUNEL染色、LDH释放检测和流式细胞术均显示神经元凋亡率随时间推移显著上升，证实体外模型可有效模拟TBI中的神经元损伤。

3.3. High expression of NSUN6 promotes axonal regeneration in the neuronal stretch injury model

基因操作验证NSUN6可有效调控后，发现NSUN6过表达显著提升损伤神经元中GAP-43和βIII-tubulin的mRNA和蛋白水平，并促进轴突延伸。相反，NSUN6敲低则抑制这些再生指标。

3.4. NSUN6 overexpression enhances m⁵C modification and mRNA stability of HMGB1

RNA测序筛选出HMGB1作为NSUN6关键下游靶点。MeRIP实验显示NSUN6过表达增加HMGB1的m⁵C修饰水平，RNA稳定性实验证实NSUN6延长HMGB1 mRNA半衰期。生物信息学预测结合双荧光素酶报告基因实验验证了特异性m⁵C修饰位点，RIP实验直接证明NSUN6与HMGB1结合。

3.5. HMGB1 knockdown inhibits axonal regeneration in the neuronal stretch injury model facilitated by NSUN6 overexpression

挽救实验表明，HMGB1敲低可逆转NSUN6过表达带来的抗凋亡效应和轴突再生促进作用，证明HMGB1是NSUN6功能执行的必要介质。

3.6. HMGB1 knockdown blocks the promotion of neuronal axons regeneration caused by NSUN6 overexpression in the TBI mouse model

体内实验进一步验证NSUN6过表达改善TBI小鼠神经功能，提高轴突再生标志物表达，而这些效应均可被HMGB1敲低所阻断。同时排除PI3K/AKT和mTOR信号通路参与此过程。

4. Discussion

本研究首次阐明NSUN6通过m⁵C修饰调控HMGB1表达促进TBI后轴突再生的新机制。这一发现不仅深化了对RNA表观遗传在神经修复中作用的理解，也为开发针对NSUN6-HMGB1轴的TBI治疗策略提供了理论依据。值得注意的是，研究同时发现NSUN6可能通过多个靶点协同促进轴突再生，这为后续研究指明了方向。尽管存在评估方法的局限性，但本研究无疑为TBI后神经再生研究开辟了新的视角。

研究结论强调，增强NSUN6表达或活性可能成为促进TBI后神经功能恢复的有效策略。未来研究可进一步探索NSUN6在其他神经系统损伤模型中的作用，以及开发靶向此通路的小分子药物，为临床治疗提供新选择。