营养调控绿色木霉合成银纳米颗粒的胞内外生物合成机制及抗菌/抗生素去除应用

《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Intracellular and Extracellular Biosynthesis, Characterization, and Antimicrobial and Antibiotic Removal Activities of Silver Nanoparticles Produced by Trichoderma viride

本研究针对如何绿色合成功能化银纳米颗粒(AgNPs)并调控其合成位点这一关键问题，研究人员通过改变绿色木霉(Trichoderma viride)的营养环境，系统探究了其胞内/胞外生物合成AgNPs的调控机制。研究发现，富有机营养条件促进胞外合成，而无机盐条件促进胞内合成，所获AgNPs在抗菌和去除水体抗生素污染物方面展现出高效能，为环境友好型纳米材料的定向合成与应用提供了新策略。

　　

在纳米科技迅猛发展的今天，银纳米颗粒(Silver Nanoparticles, AgNPs)因其独特的催化、传感、生物医学和抗菌特性而备受瞩目。然而，传统的物理或化学合成方法往往伴随着高能耗或有毒试剂的使用，存在环境不友好的弊端。相比之下，生物合成方法以其环境友好、成本低廉和安全性高等优势，为AgNPs的绿色制备开辟了新途径。尤其值得一提的是，生物合成的AgNPs表面会自然包裹一层生物大分子，这赋予了它们优异的生物相容性、增强的靶向能力以及对生物膜或微生物细胞壁的强大亲和力，使其在生物医学、抗癌治疗和抗菌领域展现出巨大的应用潜力。然而，一个关键的科学问题随之而来：如何精确调控AgNPs的合成位点（细胞内或细胞外）及其表面性质，从而定制其功能？因为合成位点的不同会直接影响AgNPs的表面包覆物，进而影响其毒性和功能表现。例如，胞外合成的纳米颗粒通常包被分泌蛋白，而胞内合成的纳米颗粒则被细胞生物膜包裹，这种膜包被的纳米颗粒结合了天然细胞膜和纳米材料的双重优势。因此，深入理解微生物胞内与胞外的合成机制，对于定制AgNPs表面特性、拓展其实际应用至关重要。

真菌，特别是绿色木霉(Trichoderma viride)，因其强大的代谢通量、高效的细胞组织、高金属耐受性、生物积累能力、金属结合能力以及菌丝的结构韧性，被认为是生物合成纳米颗粒的理想工厂。为了回答上述问题，发表在《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》上的这项研究，以绿色木霉为模型，巧妙地将营养环境作为调控开关，系统研究了其对AgNPs胞内和胞外生物合成的调控作用，并深入揭示了其背后的机制。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：1）通过改变培养基成分（富有机物的LB培养基和以无机盐为主的基础培养基MBM）来调控绿色木霉的生理状态，从而诱导AgNPs的胞内或胞外合成。2）利用多种先进的表征技术，包括倾斜扫描透射电子显微镜(STEM)、冷冻透射电子显微镜(cryo-TEM)、X射线光电子能谱(XPS)和X射线衍射(XRD)，对合成出的AgNPs的形貌、结构、元素组成和晶型进行综合分析。3）采用蛋白质表达分析技术，探究在不同营养条件下绿色木霉合成AgNPs时相关蛋白的表达变化。4）通过抗菌实验评估了不同条件下合成的AgNPs对大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和希瓦氏菌(Shewanella sp.)的抑制效果。5）测试了生物合成AgNPs对水体中抗生素污染物（如盐酸多柔比星DOX）的去除能力。

Characterization of LB/MBM-AgNPs

研究人员首先观察到营养环境对AgNPs合成位点的决定性影响。在富含有机物的LB培养基中，合成的AgNPs（LB-AgNPs）主要聚集在真菌细胞壁外，呈现区域性聚集。相反，在主要以无机盐为基础的MBM培养基中，合成的AgNPs（MBM-AgNPs）则主要位于细胞质内，尺寸更小且分布更均匀。冷冻透射电镜(cryo-TEM)结果进一步证实了这一点，清晰显示了MBM-AgNPs在细胞内的定位。X射线衍射(XRD)图谱显示两种AgNPs均呈现出面心立方银的典型晶体结构。X射线光电子能谱(XPS)分析表明，两种AgNPs中的银均以单质银(Ag⁰)和少量氧化银(Ag₂O)的形式存在。

Surface Composition and Synthesis Mechanism of LB/MBM-AgNPs

为了阐明合成机制，研究人员分析了AgNPs表面的有机组成。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)显示，LB-AgNPs表面检测到蛋白质和多糖的特征吸收峰，而MBM-AgNPs表面相关的有机信号较弱。蛋白质组学分析揭示了关键差异：在LB条件下，与还原反应相关的蛋白质（如硝基还原酶）显著上调，这促进了银离子(Ag⁺)在细胞表面的吸附、还原和成核。而在MBM条件下，与囊泡运输和高尔基体相关的蛋白质表达增加，这表明银离子在细胞内被还原后，通过囊泡运输和胞吐作用被排出细胞外。因此，营养条件通过调控微生物的生理功能和蛋白表达，进而精确控制了AgNPs的合成位点（胞外或胞内）和表面特性。

Antimicrobial Activity of LB/MBM-AgNPs

抗菌活性评估显示，不同条件下合成的AgNPs对不同微生物的抑制效果存在差异。总体而言，LB-AgNPs和MBM-AgNPs对测试的三种细菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、希瓦氏菌）均表现出抗菌活性，但其效力受细菌种类和AgNPs类型的影响。这些差异很可能与AgNPs的表面包覆物、尺寸以及与细菌细胞壁相互作用的方式不同有关。

Antibiotic Removal by LB/MBM-AgNPs

除了抗菌活性，本研究一个重要的发现是生物合成的AgNPs在环境修复方面的巨大潜力。实验结果表明，LB-AgNPs和MBM-AgNPs都能高效去除水体中的抗生素污染物盐酸多柔比星(DOX)，去除率接近100%。这凸显了生物合成AgNPs在治理水体抗生素污染方面的应用前景。

Conclusion

本研究成功演示了利用绿色木霉在环境友好条件下生物合成银纳米颗粒(AgNPs)。通过结合冷冻透射电镜等先进表征技术，研究人员直观展示了在不同营养条件下AgNPs的胞内和胞外合成过程。研究结果阐明了调控胞内与胞外AgNPs形成的不同机制：富有机营养促进细胞表面的还原和成核，而无机盐营养则促进细胞内的还原并通过胞吐作用排出。所合成的AgNPs不仅展现出抗菌活性，更重要的是在去除抗生素污染物方面表现出近乎完全的高效率。

这项研究的意义在于，它深化了我们对微生物生物合成复杂生理过程的理解，为通过调控培养条件来定向合成具有特定表面功能和增强生物活性的纳米材料提供了新的思路和平台。所采用的综合表征方法也为精确研究生物合成纳米材料提供了范例。最终，该研究强调了生物合成纳米材料，特别是AgNPs，在环境修复（如抗生素去除）和生物医学（如抗菌）领域的巨大应用潜力，为实现纳米材料的绿色制造和功能化应用开辟了新的途径。