基于快速细菌标记的表型药敏检测新方法BLAST的研发与应用

《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》：A Rapid Bacterial Labeling Method for Phenotypic Antimicrobial Susceptibility Testing

本研究针对当前抗菌药物敏感性试验(AST)流程耗时过长的问题，开发了一种基于代谢标记和点击化学的细菌快速标记方法BLAST。研究人员通过将非经典氨基酸HPG掺入新合成蛋白质，并利用荧光染料进行标记，实现了6小时内获得AST结果。该方法在105-108 CFU/mL接种量范围内均有效，对革兰氏阴性和阳性菌的MIC值与参考方法高度一致。BLAST技术为临床快速抗生素选择提供了新途径，对改善患者预后和抗生素管理具有重要意义。

　　

在当今全球公共卫生领域，细菌耐药性问题日益严峻，尤其是尿路感染(UTI)作为最常见的医院感染之一，其诊断和治疗面临着巨大挑战。传统的抗菌药物敏感性试验(AST)方法通常需要24-48小时才能获得结果，包括自动化系统在内的现有工作流程都需要细菌分离这一耗时过程。对于复杂性尿路感染(cUTI)患者而言，延迟有效的抗生素治疗可能导致严重的尿脓毒症，甚至危及生命。这种时间延迟不仅影响患者预后，还加剧了抗生素滥用和耐药菌株的传播。

在这一背景下，Joseph D. Kittle、Joel S. Lwande等研究人员在《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》上发表了一项创新研究，开发了一种名为BLAST(Bacteria Labeling Antibiotic Susceptibility Test)的快速AST方法。该方法能够在6小时内提供可靠的药敏结果，为临床医生早期制定精准治疗方案提供了可能。

研究人员采用了几项关键技术方法开展本研究。首先，他们建立了基于代谢标记的核心技术，使用非经典氨基酸homopropargylglycine(HPG)特异性标记细菌新合成蛋白质。其次，利用点击化学(click-chemistry)反应，通过铜催化的叠氮-炔环加成反应，将荧光染料AZDye 488 Azide Plus与标记的蛋白质共价结合。第三，采用96孔过滤板平台，实现了细菌保留和液体试剂高效处理的结合。研究使用了ATCC和NCTC的标准菌株，以及来自Laboratory Specialists, Inc.的多重耐药菌株E. coli LSI 770，并使用了创新研究公司提供的无菌混合人尿液样本制备细菌模拟尿液培养物。

3.1. BLAST标记响应与细菌浓度的函数关系

研究人员通过系统评估不同起始接种量(1.5×10¹至1.5×10⁸ CFU/mL)下BLAST方法的检测性能，发现当细菌浓度在1.5×10⁵至1.5×10⁸ CFU/mL范围内时，E. coli ATCC 25922和S. aureus ATCC 29213均能产生明显的信号差异。这一浓度范围正好覆盖了临床尿路感染样本中常见的细菌载量(通常≥10⁵ CFU/mL)，证明了BLAST方法在直接尿液检测中的应用潜力。

3.2. 使用分离菌株进行BLAST检测

研究团队使用分离菌株评估了BLAST方法对11种抗生素的检测性能。通过计算相对响应比(RRR)并设定0.8的cut-off值，BLAST能够准确确定最小抑菌浓度(MIC)。结果显示，E. coli ATCC 25922对所有11种抗生素的BLAST MIC值均在CLSI质量控范围内，而S. aureus ATCC 29213对9种抗生素中的8种也符合质量控制标准，仅多西环素存在差异。

3.3. BLAST与参考肉汤微量稀释法的比较

为了验证BLAST方法的可靠性，研究人员将四种细菌菌株对九种抗生素的BLAST MIC值与参考肉汤微量稀释法(rBMD)结果进行了系统比较。结果显示，绝大多数(89%)的BLAST MIC值与rBMD结果在±1稀释度内一致，包括对多重耐药菌株E. coli LSI 770的检测。尽管个别抗生素(如美罗培南和头孢西丁)存在2个稀释度的差异，但所有MIC值仍处于CLSI质控范围内。

3.4. 使用细菌模拟尿液培养进行BLAST检测

为了评估BLAST在更接近临床实际样本中的性能，研究人员使用细菌模拟尿液培养物进行了测试。结果表明，无论是直接使用尿液样本还是使用从中分离的菌落，BLAST都能产生可比较的MIC值，且与rBMD结果高度一致。这一发现证明了BLAST方法在直接检测临床尿液样本中的可行性。

研究的讨论部分强调了BLAST方法的几个重要优势。首先，该方法通过检测新蛋白质合成来评估细菌活性，不仅适用于蛋白合成抑制剂，也适用于作用于细胞壁或核酸合成的抗生素，因为细菌在应激状态下会主动关闭蛋白质合成系统。其次，BLAST采用的96孔过滤板格式使系统具有良好的可扩展性，易于实现自动化和液体处理。最重要的是，与传统AST方法需要多次细菌复制不同，BLAST基于新蛋白质合成的测量，不需要广泛的细胞复制，从而显著缩短了检测时间。

研究人员还指出，虽然本研究主要使用细菌模拟尿液样本，但未来需要开展临床患者样本研究以满足FDA对AST设备批准的要求。这些研究可能面临样本细菌滴度变异、活菌运输、阴性培养比例高、细菌污染和多种微生物样本等挑战。

该研究的创新之处在于将代谢标记技术与表型AST相结合，创建了一个快速、可靠的检测平台。BLAST方法不仅适用于常见尿路病原体，还能准确检测多重耐药菌株的药敏特性，为临床提供了一种有望实现"样本到结果"快速转化的实用解决方案。

随着抗生素耐药性问题的日益严峻，像BLAST这样的快速AST技术对于指导医疗专业人员确定有效抗生素治疗、对抗耐药菌传播以及促进新抗生素的合理使用都具有重要意义。这项研究为开发下一代感染性疾病诊断工具奠定了坚实基础，有望在未来改善患者预后、降低医疗成本并支持更有效的抗生素管理策略。