基于ESIPT-ICT机制的新型荧光探针通过酯酶样活性评估和成像血清白蛋白

《Dyes and Pigments》：A Novel ESIPT-ICT Probe for Fluorescent Assessment and Imaging of Serum Albumin via Esterase-like Activity

本研究针对传统方法难以评估人血清白蛋白（HSA）功能活性（特别是酯酶样活性HSAEA）的瓶颈，开发了新型荧光探针THOA。该探针通过HSAEA触发水解产生荧光增强的THOH，利用ESIPT-ICT协同机制实现高灵敏度检测。研究证实THOA具有优异选择性、三重线性响应特性，成功应用于临床血清筛查、细胞及斑马鱼原位成像，为HSA功能状态评估提供了创新工具。

　　

在临床医学和药物研发领域，人血清白蛋白（HSA）长期以来被视为血浆中主要的运输蛋白，负责携带脂肪酸、激素和药物分子。然而近年研究发现，这种含量丰富的蛋白质还具有类酶催化功能，其酯酶样活性（HSA_EA）在脂质代谢和前体药物活化过程中扮演关键角色。例如临床常用的阿司匹林、左旋多巴等前体药物，都需要通过HSA_EA的水解作用转化为活性形式才能发挥疗效。值得注意的是，在肝功能不全或肾病患者体内，虽然HSA的总量可能保持正常，但其酯酶活性可能出现异常，这种功能状态的改变直接影响药物代谢效率，却难以通过常规检测方法发现。

目前临床检测HSA的主流方法——溴甲酚绿（BCG）法仅能测定蛋白质的结合容量，无法反映其催化活性。免疫化学法和电化学法同样受限于原理缺陷，不能评估HSA的水解功能。更棘手的是，现有荧光探针大多存在斯托克斯位移小（<30 nm）、易受生物样本背景荧光干扰等问题，且缺乏动态监测能力和活体验证数据。这些技术瓶颈严重阻碍了对HSA功能状态的精准评估，特别是在亚临床病例的早期识别方面存在明显不足。

针对这一挑战，研究团队设计合成了一种新型荧光探针THOA，其创新性地将2-(2'-羟基苯基)苯并噻唑多环骨架与苯乙酸酯基团相结合。这种结构设计使THOA能够特异性地被HSA_EA识别并水解，生成荧光团THOH。该过程触发了激发态分子内质子转移（ESIPT）和分子内电荷转移（ICT）的协同效应，产生显著的荧光增强和大斯托克斯位移（>200 nm），有效避免了生物样本的自发荧光干扰。

为验证探针性能，研究人员开展了一系列实验。光谱分析表明，THOA与HSA作用后吸收峰从370 nm红移至420 nm，同时发射强度增强约18倍。选择性实验证实THOA对HSA_EA具有高度特异性，常见干扰物质如其他血浆蛋白、金属离子等均未引起明显响应。特别值得关注的是，THOA展现出独特的三重线性响应特性，在0.5-10 μM、10-40 μM和40-100 μM三个浓度区间均呈现良好线性关系，拓宽了动态检测范围。

在临床验证环节，研究团队收集了健康志愿者和肾病患者的血清样本进行盲法测试。结果发现，部分患者虽然BCG法检测显示HSA浓度正常，但THOA检测却提示HSA_EA活性异常。这一发现证实THOA能够识别传统方法无法检测的亚临床状态，为早期诊断提供了新思路。此外，细胞实验显示THOA可实时示踪肾小管上皮细胞对HSA的重吸收过程，斑马鱼活体成像则成功可视化内源性HSA的分布，证明其具有良好的生物应用潜力。

理论计算进一步阐明了探测机制。密度泛函理论（DFT）和含时密度泛函理论（TDDFT）计算表明，THOA水解后生成的THOH分子内氢键增强，促使ESIPT过程能垒降低，同时分子轨道能级差减小导致发射红移。这种ESIPT-ICT协同机制是产生大斯托克斯位移和高信噪比的关键。

本研究通过合成表征、光谱分析、选择性验证、临床样本检测、细胞成像、斑马鱼活体实验以及理论计算等关键技术方法，系统验证了THOA探针的应用价值。临床样本来源于健康志愿者和肾内科患者队列。

合成与表征

THOA通过三步法合成，经核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HRMS）确认结构，超高效液相色谱（UPLC）验证纯度超过99%。光谱数据表明产物具有预期的苯并噻唑-羟基苯共轭体系特征。

光谱响应

游离THOA在370 nm处有最大吸收，发射峰位于570 nm。加入HSA后吸收红移至420 nm，荧光强度显著增强，斯托克斯位移达200 nm以上。动力学实验显示水解反应符合米氏方程，表明酶促反应特性。

选择性研究

THOA对HSA表现出高度选择性，常见血浆蛋白如球蛋白、纤维蛋白原等均未引起干扰。竞争性实验证实华法林可抑制THOA水解，说明其作用于HSA的特定催化位点。

临床样本分析

在102例临床血清检测中，THOA成功识别出12例HSA结合能力正常但酯酶活性异常的亚临床病例，与传统方法相比显示出独特优势。检测结果与临床诊断符合率达96.3%。

细胞与活体成像

肾小管上皮细胞成像显示THOA可实时监测HSA重吸收过程，斑马鱼实验证实探针能穿透生物屏障实现内源性HSA可视化，且未表现出明显细胞毒性。

理论计算

DFT计算表明THOH的HOMO-LUMO能级差为2.89 eV，较THOA（3.45 eV）显著减小，与实验观测的红移现象一致。分子动力学模拟显示THOH可通过氢键与HSA活性位点稳定结合。

该研究成功开发出首个基于ESIPT-ICT协同机制的HSA_EA特异性荧光探针，突破传统方法仅检测物理浓度的局限，实现功能活性评估。THOA探针具备大斯托克斯位移、三重线性响应、良好生物相容性等优势，在药物代谢研究、疾病早期诊断和活体成像等领域展现广泛应用前景。特别在肾病患者亚临床状态识别方面表现出独特价值，为个性化用药指导提供新依据。这项发表于《Dyes and Pigments》的研究不仅推进荧光传感技术发展，更为血清白蛋白功能研究开辟新维度。