靶向NANOG介导的上皮-间质转化与自我更新可逆转结直肠癌耐药性

《eBioMedicine》：Disruption of NANOG-driven epithelial-mesenchymal transition (EMT) and self-renewal restores drug sensitivity in colorectal cancer

本研究针对结直肠癌干细胞（CRC-SC）耐药性难题，聚焦转录因子NANOG通过调控ERK/GSK-3β/β-catenin信号通路与上皮-间质转化（EMT）的关键作用。研究人员通过体外细胞模型、患者来源类器官（PDO）及小鼠体内实验，结合分子动力学模拟，证实抑制MEK（U0126）与GSK-3β（TDZD-8）可有效破坏NANOG-DNA结合，逆转干细胞特性并恢复化疗敏感性。该研究为靶向NANOG通路克服结直肠癌耐药提供了新策略。

　　

在结直肠癌治疗领域，化疗耐药和肿瘤复发是导致患者死亡的主要原因。越来越多的证据表明，癌症干细胞（CSC）在其中扮演了关键角色。这群具有自我更新和分化潜能的细胞，被认为是肿瘤发生、发展、转移和治疗抵抗的“罪魁祸首”。尤其值得注意的是，上皮-间质转化（EMT）过程与癌症干细胞的特性获得密切相关。当癌细胞发生EMT时，它们会失去上皮特征，获得间质细胞的特性，变得更具运动性和侵袭性，同时也会获得干细胞样特性。然而，驱动这一恶性转化的核心分子机制尚未完全阐明。

转录因子NANOG在胚胎干细胞中负责维持其自我更新和多能性，但其在癌症中的异常表达与不良预后相关。在结直肠癌中，NANOG的表达与淋巴结转移和晚期疾病阶段相关，暗示其可能参与癌症干细胞的调控。尽管前期研究有所提示，但NANOG如何精确调控结直肠癌干细胞的核心特性，例如其对称分裂（导致干细胞池扩增）以及对常规化疗的耐药性，其下游的关键信号通路是什么，以及能否通过靶向这些通路来消除这些干细胞从而改善治疗反应，这些重要问题仍有待深入探索。发表在《eBioMedicine》上的这项研究，正是为了回答这些关键科学问题。

为了揭示NANOG在结直肠癌干细胞中的功能，研究人员综合运用了多种关键技术。他们构建了稳定过表达NANOG的结直肠癌细胞系，利用三维（3D）结肠球培养体系来富集和研究癌症干细胞特性。研究还使用了患者来源的类器官（PDO）模型，这些类器官直接来源于结直肠癌患者的肿瘤组织，能够更好地模拟体内肿瘤的生物学特性，用于评估药物反应。在分子机制层面，研究采用了免疫印迹（Western blot）、免疫组织化学（IHC）、免疫荧光、染色质免疫沉淀（ChIP）以及双荧光素酶报告基因检测等技术。尤为突出的是，研究人员进行了深入的分子动力学模拟（MDS），在原子水平上探究了NANOG与DNA的相互作用以及小分子抑制剂如何影响这种结合。

NANOG过表达改变EMT和ERK/GSK-3β信号活性

研究人员首先发现，过表达NANOG的结直肠癌细胞形态发生了显著改变，从铺路石样变为更显纺锤形的间质细胞形态。这些细胞的迁移能力增强，伪足更长。在分子水平上，上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达下降，而间质标志物波形蛋白（Vimentin）以及EMT相关转录因子Snail和ZEB1的表达上调。同时，磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）水平升高，GSK-3β的失活形式（p-GSK-3β, Ser9）增加，进而导致β-连环蛋白（β-catenin）信号通路激活。在小鼠异种移植瘤模型中的免疫组化分析进一步证实了这些发现，表明NANOG过表达在体内外均能激活ERK/GSK-3β/β-catenin信号通路并促进EMT。

NANOG过表达细胞促进CRC-SC的对称分裂

通过3D结肠球形成实验，研究人员证实NANOG过表达显著增强了结直肠癌细胞的干细胞特性，表现为结肠球形成效率提高。利用CD44报告基因和免疫荧光染色，他们发现NANOG过表达细胞中干细胞标志物CD44表达上调，而分化标志物MUC2表达下调。更重要的是，通过BrdU脉冲-追踪和配对细胞实验，研究揭示NANOG过表达促使细胞分裂模式从不对称分裂（ACD）向对称分裂（SCD）转变。在对称分裂中，两个子代细胞都继承了干细胞特性，从而导致癌症干细胞池的扩增。这表明NANOG通过促进对称分裂来维持和扩增结直肠癌干细胞群体。

MEK抑制剂U0126和GSK-3β抑制剂TDZD-8靶向NANOG活性

接下来，研究评估了靶向NANOG相关通路能否克服其介导的耐药性。细胞毒性实验显示，过表达NANOG的细胞对MEK抑制剂U0126和GSK-3β抑制剂TDZD-8的半数抑制浓度（IC₅₀）更高，表现出耐药性。在患者来源类器官（PDO）中，高表达NANOG的类器官对这两种抑制剂的敏感性也较低。然而，当使用较低浓度（非细胞毒性剂量）的抑制剂处理时，U0126和TDZD-8能够诱导对照结肠球发生分化（失去囊状形态），而NANOG过表达的结肠球则能更好地维持其未分化的干细胞状态。同时，这两种抑制剂能有效降低NANOG过表达细胞中p-ERK1/2和β-catenin的水平，并逆转EMT标志物的表达。当与临床药物（如贝伐珠单抗、西妥昔单抗、雷莫西尤单抗）联合使用时，U0126和TDZD-8能够显著抑制高NANOG表达PDO的存活，提示联合靶向策略可能有效克服NANOG驱动的耐药。

NANOG-DNA结合被TDZD-8和U0126调控的机制

为了深入理解抑制剂的作用机制，研究人员进行了分子动力学模拟。模拟结果显示，TDZD-8和U0126能够与NANOG-DNA复合物结合，改变其构象动力学，减少NANOG与DNA之间的氢键数量，增加结合能，从而可能破坏NANOG与其靶基因启动子的结合稳定性。实验证据支持了这一发现：染色质免疫沉淀（ChIP）实验表明，经U0126或TDZD-8处理后，NANOG在靶基因（如ZEB2）启动子区域的占据减少。竞争性ELISA和Western blot实验也证实，这些抑制剂能直接干扰NANOG与DNA的结合。

NANOG相关基因表达谱的变化

通过筛选45个NANOG潜在靶基因，研究发现NANOG过表达会导致与干性（如SOX2, OCT4）、对称分裂（如FOXP1, BMI1）和EMT（如ZEB2, TWIST）相关的基因表达上调。而用U0126或TDZD-8处理则能逆转这些基因的表达变化，例如抑制BMI1、ZEB2等基因的表达，同时上调DKK1等基因。这表明这些抑制剂通过调控NANOG的转录活性来影响其下游网络。

肿瘤微环境（TIME）和细胞外基质（ECM）的调节

在癌细胞、单核细胞和成纤维细胞共培养体系中，U0126和TDZD-8处理减少了癌细胞的面积和癌细胞与单核细胞的比率。qRT-PCR分析显示，这两种抑制剂能上调某些细胞外基质和粘附相关基因（如FN1, LAMA1），同时下调一些蛋白酶解和免疫相关基因（如MMP10, IL6），表明它们可以重塑肿瘤微环境。

临床相关性分析

对癌症基因组图谱（TCGA）数据库和临床结直肠癌样本的分析显示，NANOG的mRNA和蛋白表达水平在晚期肿瘤中更高，并且与β-连环蛋白（β-catenin）、ZEB1、波形蛋白（Vimentin）等表达呈正相关，与E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达呈负相关。这进一步支持了NANOG-EMT-β-catenin轴在临床结直肠癌进展中的重要性。

本研究得出结论，转录因子NANOG是结直肠癌干细胞维持其特性的核心驱动因子。它通过激活ERK/GSK-3β/β-catenin信号通路，诱导上皮-间质转化（EMT），并促进癌症干细胞的对称分裂，从而加剧肿瘤的恶性进展和化疗耐药。研究的创新之处在于，不仅阐明了NANOG的下游作用机制，还通过计算模拟和实验验证，发现临床前小分子抑制剂U0126（MEK抑制剂）和TDZD-8（GSK-3β抑制剂）能够直接干扰NANOG与DNA的结合，破坏其转录调控功能，进而逆转干细胞特性和耐药表型。尽管U0126和TDZD-8本身并非临床药物，但其揭示的靶向NANOG通路策略具有重要的转化意义。该研究为开发针对癌症干细胞的新疗法提供了坚实的理论依据和潜在的干预靶点，对于克服结直肠癌的耐药和复发挑战具有深远的影响。未来的研究可进一步探索特异性更高的NANOG抑制剂，并将其与现有化疗、靶向治疗或免疫治疗联合应用，以期最终改善结直肠癌患者的预后。