褪黑素通过调控氧化应激诱导的自噬和抑制炎症小体激活缓解瘤胃上皮功能障碍

《Food Bioscience》：Melatonin alleviates ruminal epithelial dysfunction by regulating oxidative stress-induced autophagy and inhibiting inflammasome activation

本研究针对反刍动物亚急性瘤胃酸中毒(SARA)导致的瘤胃上皮屏障损伤问题，探讨了褪黑素通过抗氧化作用修复上皮屏障的机制。研究人员发现褪黑素通过ERK/mTOR通路调节自噬水平，进而影响NLRP3炎症小体活性，最终恢复紧密连接蛋白(Claudin-1、Occludin和ZO-1)表达。该研究为SARA相关上皮屏障功能障碍提供了新的治疗靶点。

　　

随着集约化养殖技术的发展，反刍动物被饲喂大量谷物组成的高营养浓度日粮，这使得它们更容易患上亚急性瘤胃酸中毒(SARA)。SARA不仅会导致局部炎症反应和上皮屏障破坏，还会进一步降低全身免疫力并引发远端器官反应。瘤胃上皮屏障功能与紧密连接(TJ)蛋白的表达水平密切相关，而SARA会显著降低claudins、occludin(OCC)和zonula occludens-1(ZO-1)的丰度，破坏TJ定位，大大增强有害物质通过瘤胃上皮的通道，诱发全身性炎症。

尽管SARA损害瘤胃上皮紧密连接的机制尚未完全阐明，但革兰氏阴性菌细胞壁成分脂多糖(LPS)被认为是导致上皮功能障碍的关键因素。SARA期间局部瘤胃炎症和微生物代谢紊乱引起的活性氧(ROS)过量产生可能导致氧化应激。此外，ROS及其氧化副产物会维持肠道炎症并进一步损害屏障功能，这表明SARA的进展与瘤胃中过量的ROS有关。

自噬作为一种保守的细胞自我降解途径，在自噬溶酶体内促进细胞质细胞器、蛋白质和大分子成分的转移和回收。在稳态条件下，自噬过程能够实现降解细胞成分的细胞内回收，支持细胞稳态，同时保持结构完整性和功能能力。然而在病理应激条件下，自噬流失调会触发必需细胞蛋白和生理细胞器的异常降解，导致程序性细胞死亡通路。研究发现，调节过度自噬可以增强肠道上皮TJ蛋白（如claudin-1(C1)和ZO-1）的表达，有助于恢复肠粘膜损伤。这表明靶向自噬治疗可能是恢复瘤胃上皮屏障功能障碍的潜在方法。

ROS作为信号分子调节自噬体的形成和降解。在衣霉素诱导的肠道氧化应激模型中，异常的自噬流会损害上皮屏障。因此，瘤胃上皮氧化应激可能影响自噬，这需要进一步研究。细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)通过抑制氧化应激和过度自噬来调节肠道屏障。雷帕霉素机制靶点(mTOR)作为自噬起始的关键调节因子，受到ERK的抑制。自噬调节剂雷帕霉素(RAPA)被证明可以预防LPS诱导的小鼠肠道TJ屏障损失。然而，瘤胃上皮细胞自噬中的ERK/mTOR轴需要进一步研究，特别是在氧化应激期间。

肠道上皮细胞的自噬在生理学中发挥着重要作用，包括维持屏障功能。但其在SARA中的作用尚不清楚。自噬机制通过多种分子途径调节核苷酸结合寡聚化结构域富含亮氨酸重复序列受体的激活，特别是NLR家族pyrin结构域包含3(NLRP3)炎症小体复合物。例如，巨噬细胞中的自噬缺陷可作为NLRP3的激活剂。这表明NLRP3可能是自噬介导的瘤胃上皮细胞(RECs)TJ损伤的核心。NLRP3也可以被氧化应激激活，与凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和pro-caspase-1组装成多蛋白复合物，激活Caspase-1并增强白细胞介素-1β(IL-1β)的分泌。NLRP3激活会加剧炎症，其抑制是开发针对消化道的抗炎药物的有前景的方法。在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎啮齿动物模型中，通过抑制NLRP3和caspase-1信号级联对NLRP3炎症小体通路进行药理学调节，通过上调TJ相关蛋白（特别是ZO-1和OCC）恢复了肠道屏障功能。然而，ROS/自噬/NLRP3轴在SARA期间瘤胃上皮屏障损伤中的参与仍有待探索。

总之，SARA期间瘤胃屏障功能的损害可能源于上皮细胞的过氧化。研究表明，胃肠道粘膜是松果体外产生褪黑素的主要来源之一。褪黑素具有多种生物学功能，包括增强肠粘膜屏障功能以及保护细胞免受氧化和炎症损伤。在LPS诱导的肠道凋亡和氧化应激模型中，褪黑素降低了超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)水平。然而，其对反刍动物SARA期间氧化应激下瘤胃上皮屏障的保护作用尚未见报道。

本研究主要采用了以下关键技术方法：通过高精料饲喂建立羊SARA模型，使用LPS构建瘤胃上皮屏障损伤的体外模型，应用氧化应激指标(ROS、MDA、CAT、SOD、GSH)检测技术，采用蛋白质印迹法分析紧密连接蛋白(Claudin-1、Occludin、ZO-1)和自噬相关蛋白(P62、Beclin1、LC3Ⅱ)表达，利用药理学抑制剂(NAC、氯喹、U0126、MCC950)进行通路验证。

高精料饮食诱导羊SARA并损伤上皮屏障

通过7:3的精粗比饲喂方法成功建立了SARA模型。虽然SARA组羊比对照组增重更多，但瘤胃pH保持在5.8以下超过3小时，创造了符合SARA构建标准的异常酸性环境。结果表明，高精料饲喂降低了紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的蛋白表达，证实了上皮屏障功能的损伤。

褪黑素通过抗氧化作用修复上皮屏障

研究发现SARA期间瘤胃中氧化应激水平升高(ROS、MDA、CAT、SOD和GSH)。ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和褪黑素在上调关键紧密连接蛋白(Claudin-1、Occludin和ZO-1)表达方面具有相当的治疗效果。这表明褪黑素通过其抗氧化特性有效修复SARA引起的瘤胃上皮屏障损伤。

自噬在屏障损伤中的作用机制

瘤胃上皮屏障损伤触发了过度激活的自噬(P62、Beclin1和LC3Ⅱ)。在体外，NAC和褪黑素逆转了LPS诱导的瘤胃上皮细胞过度自噬。自噬抑制剂氯喹恢复了TJs，而自噬激活剂雷帕霉素则抵消了这种修复作用。ERK抑制剂U0126的添加证实了ERK/mTOR是自噬导致瘤胃上皮屏障破坏的关键通路。

NLRP3炎症小体的作用

抑制剂MCC950对TJs的影响表明，NLRP3炎症小体(NLRP3、ASC和IL-1β)是氧化应激诱导自噬的重要靶点。研究证实了NLRP3在氧化应激诱导的自噬中的关键作用，为理解SARA病理机制提供了新视角。

本研究得出结论：瘤源褪黑素有助于缓解SARA诱导的瘤胃上皮细胞氧化应激，这些效应与通过ERK/mTOR信号通路调节自噬水平有关。SARA期间瘤胃褪黑素的内源性激增代表了一种进化适应反应，表明其作为早期SARA诊断生物标志物和具有最小脱靶效应治疗剂的潜力。该研究结果为开发针对瘤胃上皮屏障功能障碍的靶向治疗干预措施提供了新的机制途径，为反刍动物代谢疾病防治提供了重要理论依据。