枯草芽孢杆菌K6固态发酵调控亚麻籽粕膳食纤维结构转化与功能增效的机理研究

《Food Chemistry: X》：Mechanistic insights into the Bacillus subtilis K6 solid-state fermentation-induced structural transformation and enhanced bioactivity of flaxseed meal dietary fiber

本研究针对亚麻籽粕膳食纤维(DF)功能特性不足的问题，通过枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K6固态发酵(SSF)技术，系统解析了可溶性膳食纤维(SDF)和不溶性膳食纤维(IDF)的结构转化机制及其生物活性提升规律。研究发现发酵有效促进了IDF向SDF的转化(SDF含量提升36.92%)，并通过转录组学揭示了戊糖葡萄糖醛酸互变和淀粉蔗糖代谢为关键降解通路。体外功能评价表明发酵SDF(F-SDF)在胆固醇吸附、胰脂肪酶抑制等方面表现突出，为亚麻籽粕高值化利用提供了理论依据。

　　

亚麻籽作为重要的油料作物，其榨油后的副产物亚麻籽粕(Flaxseed Meal, FSM)含有丰富的膳食纤维(Dietary Fiber, DF)，但长期以来主要被用作低价值动物饲料，未能得到有效利用。膳食纤维作为植物性食品的重要组成成分，根据水溶性可分为可溶性膳食纤维(Soluble Dietary Fiber, SDF)和不溶性膳食纤维(Insoluble Dietary Fiber, IDF)。SDF因其更高的持水力、粘度、发酵性以及凝胶和乳化能力，通常表现出比IDF更优的生物活性和加工适应性。然而，天然植物细胞壁中IDF占主导地位，其结晶纤维素微纤维赋予的结构刚性限制了SDF的可及性。研究表明，DF要发挥最佳功能特性，其SDF含量需超过10%。因此，开发有效的改性策略将IDF转化为SDF，对于提升膳食纤维的功能性、推动亚麻籽粕的高值化利用至关重要。

微生物发酵作为一种绿色、高效的改性手段，受到广泛关注。在发酵过程中，微生物通过分泌酶类水解复杂多糖，不仅能增加SDF含量，还能诱导膳食纤维基质发生结构重组，如改变孔隙率、表面形态和聚合物构象，从而调控其理化和功能属性。近年来，组学技术的应用为深入解析微生物对底物的代谢机制提供了有力工具。然而，关于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵调控亚麻籽粕膳食纤维结构转化及功能增效的机理，特别是从转录组学层面揭示关键酶系的作用，尚缺乏系统研究。

为解决上述问题，河南工业大学食品科学与工程学院的研究团队在《Food Chemistry: X》上发表了题为"Mechanistic insights into the Bacillus subtilis K6 solid-state fermentation-induced structural transformation and enhanced bioactivity of flaxseed meal dietary fiber"的研究论文。该研究旨在探究枯草芽孢杆菌K6发酵对亚麻籽粕中SDF和IDF结构特性及生物活性的影响，并利用转录组学技术鉴定发酵过程中的关键酶，为开发源自亚麻籽粕的高价值膳食纤维产品提供理论依据和新视角。

为开展本研究，研究人员采用了多种关键技术方法。首先，在优化的固态发酵(SSF)条件下（发酵时间45小时，温度40.5°C，料液比1:0.65，接种量10%）对亚麻籽粕进行发酵。随后，通过酶法（热稳定α-淀粉酶和碱性蛋白酶）结合乙醇沉淀法，从发酵前后亚麻籽粕中分别提取SDF和IDF。对提取的膳食纤维进行了系统的结构表征，包括扫描电子显微镜(SEM)观察表面形貌，傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析官能团，X射线衍射(XRD)测定晶体结构，热重分析(TGA)评估热稳定性，离子色谱分析单糖组成，以及尺寸排阻色谱-多角度激光光散射-示差折光检测器(SEC-MALLS-RI)联用测定分子量分布。此外，对发酵8小时的样品进行转录组测序，通过基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析，筛选与膳食纤维解离相关的差异表达基因和代谢通路。最后，通过体外实验评估了膳食纤维的葡萄糖吸附能力(GAC)、胆固醇吸附能力(CAC)、胰脂肪酶抑制活性(PLIC)、亚硝酸根离子吸附能力(NIAC)和胆酸钠吸附能力(SCAC)等生物活性。

3.1. 发酵前后SDF和IDF含量及化学成分分析

研究发现，发酵后SDF含量从24.43%显著增加至33.45%（相对增加36.92%），而IDF含量从40.77%下降至28.27%（相对减少30.66%）。这表明枯草芽孢杆菌K6发酵有效促进了IDF向SDF的转化。同时，SDF和IDF中的蛋白质含量均有所下降，有助于提高膳食纤维的纯度。

3.2. SEM分析

扫描电镜结果显示，发酵前后SDF和IDF的微观结构发生显著变化。未发酵SDF(CK-SDF)表面粗糙不规则，而发酵SDF(F-SDF)表面相对平滑，出现皱褶和微裂缝。未发酵IDF(CK-IDF)呈现多孔结构，而发酵IDF(F-IDF)表面形态扭曲，部分结构坍塌，内部包裹的球形颗粒暴露更充分。这些变化表明固态发酵破坏了SDF和IDF的原始结构，使其结构更为疏松，比表面积增加。

3.3. FTIR分析

傅里叶变换红外光谱分析表明，发酵引起了分子水平的结构扰动。F-SDF在1603.4 cm^?1（COO^?或C=O基团）和1040.1 cm^?1（糖环中C-O伸缩振动）处的吸收峰强度显著降低，表明发酵诱导了果胶和半纤维素中部分键的断裂。F-IDF在1057.1 cm^?1处的吸收峰强度降低，表明发酵导致了不溶性半纤维素中C-O键的部分断裂。

3.4. XRD分析

X射线衍射分析显示，发酵并未改变SDF和IDF的晶体结构类型，但影响了其衍射强度。F-SDF的衍射强度显著低于CK-SDF，归因于发酵过程中微生物分泌的水解酶破坏了分子间键，将结晶纤维素转化为无定形纤维素。相反，F-IDF在18.52–24.92°衍射角范围内的衍射强度高于CK-IDF，可能是由于不稳定的无定形区（如半纤维素和部分纤维素）被分解，或发酵诱导分子链排列更紧密有序所致。

3.5. TGA分析

热重分析表明，膳食纤维的热解分为三个阶段：水分蒸发（30–180°C）、主要多糖链断裂降解（180–380°C）和碳化阶段（380–600°C）。F-SDF的热稳定性略低于CK-SDF，可能是由于发酵造成的结构破坏使其更易热降解。而F-IDF的热稳定性略高于CK-IDF，可能与发酵过程中形成新的分子间作用力有关，这与XRD结果中F-IDF分子堆积更紧密的发现一致。

3.6. 单糖组成分析

离子色谱分析揭示了发酵前后SDF和IDF单糖组成的变化。CK-SDF的主要单糖为木糖、鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖，表明其主要由半纤维素和果胶组成。发酵后，F-SDF中葡萄糖和半乳糖含量显著增加，而阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖醛酸含量降低，表明发酵过程中细胞壁纤维素和半纤维素结构被降解。CK-IDF和F-IDF的主要单糖为木糖、阿拉伯糖和葡萄糖，表明IDF主要由纤维素和半纤维素组成。发酵后，F-IDF中阿拉伯糖含量显著降低，木糖含量增加，反映了半纤维素的降解和微生物对阿拉伯糖的利用。

3.7. 分子量分析

分子量分布分析显示，发酵后SDF的分子量从796.643 kDa降至486.413 kDa，IDF的分子量从1360.590 kDa显著降至511.657 kDa。分子量的降低归因于发酵过程中微生物分泌的酶将长链聚合物水解为低分子量寡糖和单糖。较低的分子量和改善的溶解度有利于膳食纤维的功能特性和益生元潜力。

3.8. 转录组学解析枯草芽孢杆菌K6解离膳食纤维的机制

对发酵8小时的样品进行转录组学分析，共鉴定出2529个显著差异表达基因（1310个上调，1219个下调）。KEGG富集分析发现，戊糖和葡萄糖醛酸互变以及淀粉和蔗糖代谢是与膳食纤维解离最相关的两条代谢通路。对通路中关键酶的分析表明，上调的酶主要分为氧化还原酶、裂解酶、转移酶、水解酶和异构酶五大类。其中，水解酶是枯草芽孢杆菌K6降解膳食纤维的关键酶系。例如，α-1,4-多聚半乳糖醛酸酶(lplD)可切割果胶主链的α-1,4-糖苷键；β-呋喃果糖苷酶(sacA)催化β-呋喃果糖苷键水解；内切-β-1,4-甘露聚糖酶(gmuG)作用于半乳甘露聚糖等产生甘露寡糖；α-半乳糖苷酶(melA)和β-半乳糖苷酶(yesZ)则分别水解α和β-半乳糖苷键。这些酶协同作用，破坏了膳食纤维的主链和支链结构，导致其充分解离，从而引起单糖组成、分子量和微观结构的改变，进而影响其生物活性。

3.9. 发酵亚麻籽粕膳食纤维的GAC

体外葡萄糖吸附能力测定显示，发酵后F-SDF和F-IDF的葡萄糖吸附能力均略高于其未发酵对照。F-IDF的葡萄糖吸附能力(14.40 mg/g)高于F-SDF(11.15 mg/g)，这可能与发酵IDF具有更大的比表面积有关，而F-SDF较高的结晶度可能阻碍葡萄糖进入其内部结构。

3.10. 发酵亚麻籽粕膳食纤维的CAC

胆固醇吸附能力评估表明，发酵显著增强了膳食纤维的胆固醇吸附能力，且在肠道条件(pH 7)下的吸附量高于胃条件(pH 2)。F-SDF在pH 7时表现出最高的胆固醇吸附效率(10.76 mg/g)。在中性环境中，SDF中的羧基解离成羧酸根阴离子，有助于与胆固醇结合。此外，SDF的高持水力和溶胀能力使其能形成凝胶状结构，包裹胆固醇。

3.11. 发酵亚麻籽粕膳食纤维的PLIC

胰脂肪酶抑制活性测定结果显示，F-SDF的抑制活性最高(19.19%)。F-SDF更大的比表面积、更低的分子量和多孔基质改善了其对脂质底物和脂肪酶的包埋能力，从而增强了抑制效果。

3.12. 发酵亚麻籽粕膳食纤维的NIAC

亚硝酸根离子吸附能力测试表明，所有样品在pH 2条件下的吸附量均显著高于pH 7条件。F-SDF在pH 2时吸附能力最强(278.5 μg/g)。在酸性环境下，亚硝酸根离子质子化形成亚硝酸，易于与膳食纤维基质中富电子的酚羟基发生亲电相互作用，从而被有效清除。发酵后F-SDF结构改性（如孔隙率增加、结合酚酸释放）可能增加了反应位点的可及性。

3.13. 发酵亚麻籽粕膳食纤维的SCAC

胆酸钠吸附能力测定发现，F-SDF的吸附能力(9.55 mg/g)显著高于其他样品。这与发酵后SDF结构变得疏松、比表面积增加，从而暴露了更多与胆酸钠结合的位点有关。

本研究通过枯草芽孢杆菌K6固态发酵，成功实现了亚麻籽粕膳食纤维的结构改性和功能提升。研究系统阐明了发酵诱导的SDF和IDF在微观结构、晶体结构、热稳定性、单糖组成和分子量等方面的变化规律。转录组学分析首次从分子水平揭示了枯草芽孢杆菌K6解离膳食纤维的关键代谢通路（戊糖葡萄糖醛酸互变、淀粉蔗糖代谢）和以水解酶为主的关键酶系作用机制。体外功能评价证实，发酵显著增强了SDF在胆固醇吸附、胰脂肪酶抑制、亚硝酸盐和胆酸盐吸附等方面的生物活性，而IDF则在葡萄糖吸附方面表现更优。这些发现不仅为亚麻籽粕的高值化利用提供了坚实的理论依据和技术路径，也为微生物改性膳食纤维在功能性食品配料开发中的应用提供了新的思路和策略。该研究深化了对微生物发酵调控膳食纤维结构-功能关系的理解，对推动农产品加工副产物的资源化利用和功能性食品产业发展具有重要意义。