金黄色葡萄球菌鼻腔定植竞争力由生物素合成与摄取机制决定

《The ISME Journal》：Competitive fitness of Staphylococcus aureus against nasal commensals depends on biotin biosynthesis and acquisition

本研究针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在营养受限的鼻腔环境中与共生菌竞争的分子机制展开探索。通过构建生物素合成(bioA)及转运蛋白(bioY)缺陷株，结合体外共培养、生物素定量检测、膜流动性分析等技术，首次揭示生物素(biotin)的可获得性通过调控脂肪酸合成关键酶Acc活性影响细菌膜完整性，进而决定其竞争适应性。研究发现，鼻腔分泌物中生物素浓度仅约1 nM，而具有高亲和力转运系统BioY的菌株可通过“分泌-重摄取”策略减少代谢损耗，同时在多物种共存环境下限制共生菌对生物素的获取。该研究发表于《The ISME Journal》，为理解鼻腔微生物互作提供了新视角，并为针对营养竞争的抗病原菌定植策略开发奠定基础。

　　

人类鼻腔是一个复杂的微生物栖息地，其中既存在有益共生菌，也潜伏着如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）这样的机会性病原体。约30%的健康人群鼻腔中携带S. aureus，其定植状态是后续感染的重要风险因素。研究表明，鼻腔内其他共生微生物（如棒杆菌属Corynebacterium、表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis等）可通过产生抗菌物质或营养竞争等方式抑制S. aureus的定植，但其中的具体分子机制，尤其是在营养匮乏的鼻腔环境中细菌间如何争夺必需微量营养素，仍有很多未知。鼻腔分泌物代谢组学分析显示，其单糖、氨基酸浓度低，微量元素因螯合分子而受限，而包括维生素在内的微量营养素甚至难以检测到。这暗示着微生物之间可能存在着对有限必需营养素的激烈竞争，或者存在通过共享“公共物品”进行的协作性交叉喂养（cross-feeding）互动。生物素（维生素B₇）是所有生物体必需的辅酶，参与羧化、脱羧和转羧基反应，对糖异生、脂肪酸合成和氨基酸分解代谢至关重要。S. aureus虽然拥有完整的生物素合成操纵子（bioDABF），能够自身合成生物素，但其 biosynthesis 过程极其耗能，需要消耗约19-20个ATP等价物。同时，S. aureus也编码高亲和力的ECF型ABC转运蛋白BioY，用于从环境中摄取生物素。在鼻腔这一生物素浓度极低（约1 nM）的环境中，生物素的合成与摄取如何影响S. aureus的生理及其与鼻腔共生菌的相互作用，是一个亟待解答的科学问题。

为探究上述问题，研究人员主要运用了以下几项关键技术：利用基因编辑技术构建S. aureus USA300 JE2菌株的生物素合成基因（bioA）和转运蛋白基因（bioY）的标记缺失突变体及其染色体互补株；使用链霉亲和素处理的Tris最小琥珀酸盐培养基（sTMS）模拟鼻腔生物素限制环境进行体外培养；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测人血清、鼻腔分泌物及细菌培养上清液中的生物素浓度；采用链霉亲和素印迹（Streptavidin blot）技术检测细菌细胞内生物素化蛋白（如丙酮酸羧化酶Pyc和乙酰辅酶A羧化酶Acc）的表达；利用膜流动性检测试剂盒评估生物素限制对细菌膜物理性质的影响；建立荧光标记（GFP）的S. aureus与未标记的鼻腔共生菌的液体及固体平板共培养体系，并通过监测光密度（OD₆₀₀）和荧光信号计算竞争适应性指数（CF-I），以量化菌株间的竞争关系。

结果1：适当的生物素水平对S. aureus USA300 JE2的正常生理功能至关重要

S. aureus USA300 JE2野生型（JE2 WT）能够在无生物素的sTMS培养基中生长，而生物素合成基因bioA的缺失突变体（ΔbioA）则完全无法生长，此表型可被染色体回补（ΔbioA::bioA）所挽救。滴定实验表明，4 nM的外源生物素足以使ΔbioA突变体恢复至野生型生长水平。通过ELISA检测发现，人血清和鼻腔分泌物中的生物素浓度均约为1 nM，处于S. aureus生理相关浓度范围的低限。链霉亲和素印迹显示S. aureus表达两种生物素化酶：丙酮酸羧化酶（Pyc, 128.5 kDa）和乙酰辅酶A羧化酶（Acc, 表观分子量约25 kDa）。Pyc缺陷株在生物素限制条件下生长未受影响，表明在此实验条件下该酶非必需。研究人员推测生物素限制主要影响Acc介导的脂肪酸合成。实验证实，在严格生物素限制（100 pM）下，ΔbioA突变体的膜流动性显著高于野生型，补充生物素可逆转此现象。此外，生物素限制对S. aureus生长的影响在30°C（模拟鼻腔温度）时尤为显著。

结果2：生物素转运蛋白BioY提升S. aureus适应性并减少生物素向环境流失

在30°C下，补充4 nM生物素能显著促进原养型JE2 WT的生长，缩短代时。随着外源生物素浓度增加，生物素合成基因bioA的表达下调，表明S. aureus在内部生物素充足时会减少耗能的生物素合成。BioY转运蛋白缺失突变体（ΔbioY）在含有4 nM生物素的sTMS中表现出延长的滞后期和降低的最终光密度，此表型可被回补。有趣的是，即使在无外源生物素条件下，ΔbioY突变体也表现出生长缺陷。进一步实验发现，ΔbioY突变体的培养上清液中可检测到约500 pM的生物素，而野生型上清液中则检测不到，且两者最终菌落形成单位（CFU）无差异。这表明S. aureus会持续将内源合成的生物素泄漏到环境中，而BioY依赖的再摄取可最大限度地减少这种损失。ΔbioY突变体的上清液能有效支持ΔbioA突变体的生长，而野生型上清液则不能。

结果3：鼻腔共生菌表现出多样的生物素营养缺陷型和过量生产表型

对鼻腔分离菌株的基因组分析显示，生物素营养缺陷型（auxotrophy）是常见特征，尤其在凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）中普遍存在。体外生长实验证实了基因组预测，许多预测为原养型（prototrophic）的菌株（如S. epidermidis, Corynebacterium spp.）在实际培养中无法在无生物素sTMS中生长，暗示存在其他生长限制。所有能在无生物素培养基中生长的菌株均向环境中释放生物素，但释放量差异巨大：S. aureus释放量较低（~200 pM），而某些革兰氏阴性菌和Bacillus cereus菌株释放量可高出6-25倍。缺乏生物素转运蛋白YigM的E. coli突变体（yigM::Kan）上清液中生物素有积累趋势，提示生物素“流失-重摄取”机制可能在多种细菌中保守。

结果4：生物素的释放和BioY依赖性摄取促进了鼻腔细菌与S. aureus的相互作用

鼻腔共生菌的培养上清液能够以剂量依赖的方式（r=0.73, P=0.0250）促进S. aureus ΔbioA突变体的生长，且促进程度与上清液中生物素浓度正相关。反之，S. aureus ΔbioY突变体的上清液（富含生物素）能显著促进多种营养缺陷型CoNS（如S. capitis, S. lugdunensis）的生长，而野生型S. aureus上清液则不能。在竞争性共培养实验中，与ΔbioY突变体相比，拥有完整BioY转运系统的S. aureus野生型在面对大多数鼻腔共生菌竞争者时表现出更高的竞争适应性指数（CF-I），特别是在与某些S. aureus菌株（SA18, SA146）竞争时优势明显，表明这些竞争者从ΔbioY突变体泄漏的生物素中获益。在模拟鼻腔附着生长的sTMS固体平板上，ΔbioY突变体需要比野生型高1-3个数量级的接种密度才能在共生菌菌苔上形成可见菌落，进一步证实了生物素竞争在表面定植中的重要性。在多物种共培养体系中，BioY的重要性在面临强劲竞争者（如K. michiganensis, B. cereus 272）时尤为突出。

本研究系统阐明了生物素的可获得性在塑造鼻腔微生物群落结构中的核心作用。S. aureus作为生物素原养型菌，其竞争适应性不仅依赖于内源合成，更得益于通过高亲和力转运蛋白BioY对环境中（包括自身泄漏和共生菌释放）生物素的高效摄取。这种“合成-泄漏-重摄取”策略一方面优化了其能量代谢，另一方面也限制了公共资源（生物素）被营养缺陷型竞争者利用，从而在营养竞争中占据优势。鼻腔环境中极低的生物素浓度（~1 nM）加剧了这种竞争。研究揭示了细菌通过控制必需微量营养素的流通来调节种间互作的新机制，即代谢溢出（metabolic overflow）和特异性转运系统共同介导的“公共物品”经济。该发现不仅深化了对S. aureus鼻腔定植机制的理解，也为通过干预营养竞争来控制病原菌定植（例如，利用生物素类似物或靶向BioY的策略）提供了新的思路和潜在靶点。生物素介导的相互作用可能是微生物群落中普遍存在的、影响物种共存和群落稳定性的重要生态力量。