利用体温辅助的DEMBA技术实现无需设备的核酸检测

《ACS Omega》：Device-Free Nucleic Acid Detection Enabled by Body Temperature-Assisted DEMBA

核酸体温检测新方法：内切酶依赖型分子信标联用侧流层析技术实现单链DNA/RNA快速可视化分析。

　　本研究提出了一种全新的核酸检测方法，即基于体温的内切酶依赖性分子信标检测法（DEMBA）。该方法利用人体体温（37°C）作为反应条件，能够在无需额外加热设备的情况下实现对单链DNA（ssDNA）和单链RNA（ssRNA）的快速、准确检测。与传统的检测方法相比，DEMBA具有显著的优势，例如无需逆转录步骤，减少了检测时间，同时提高了检测的稳定性和可靠性。这一技术突破为实现更简便、高效的现场检测提供了新的思路。

在本研究中，我们设计了两种DEMBA探针（PA和PB），分别基于不同的限制性内切酶识别位点（Bpu10I和Bpu1102I）。通过NUPACK软件预测了这些探针的二级结构，确保其在体温条件下能够保持稳定，并在目标序列存在时发生特异性结构变化。随后，我们进行了实验验证，使用4.5%琼脂糖凝胶电泳分析了探针的行为、与目标序列的相互作用以及内切酶切割产物。实验结果表明，当目标序列存在时，探针能够被特异性切割，从而释放荧光信号，而当目标序列缺失时，荧光信号则较弱。这进一步验证了DEMBA方法的特异性和灵敏度。

为了增强检测的可视化能力，我们还将DEMBA方法与胶体金侧流检测技术相结合。这种集成方式使得检测结果可以在没有专业设备的情况下直接读取。在侧流检测中，探针被双标记：5′端使用荧光标记（6-FAM）用于荧光监测，3′端使用生物素用于侧流条带的识别。当探针未被切割时，完整的探针会与胶体金-抗生物素抗体复合物结合，形成稳定的复合结构，随后在测试条上迁移并结合到固定的抗FAM抗体上，从而产生紫色信号，表示阴性结果。相反，当探针被内切酶切割后，形成的探针片段缺乏3′端的生物素标记，无法与抗FAM抗体结合，导致测试条上的T线未显色，从而提示阳性结果。此外，无论是否发生切割，所有探针-抗体-胶体金复合物都会迁移至C线（控制线）并结合到固定的抗鼠抗体上，确保检测的可靠性。

为了确保侧流检测的准确性，我们对反应产物进行了适当的稀释处理。通过调整稀释倍数，使得在没有目标序列的阴性对照组中，测试条上未出现明显的阳性信号，而在最低检测灵敏度的目标序列组中，测试条能够清晰地显示出阳性结果。这一过程有效地降低了背景干扰，提高了检测的可区分性。然而，目前DEMBA方法仍存在一定的局限性，例如探针在体温条件下的稳定性不足，可能影响检测性能。因此，未来的研究需要进一步优化探针结构和反应条件，以提升其灵敏度和特异性。

在荧光检测方面，我们使用实时PCR系统对不同浓度的目标序列进行了分析。实验结果显示，当目标序列浓度较低时，荧光信号的变化并不呈现明显的浓度依赖性，但随着目标序列浓度的增加，荧光信号逐渐增强。此外，荧光曲线在大约10分钟后趋于平稳，表明反应达到了平衡状态。值得注意的是，在检测ssRNA时，荧光信号的变化比检测ssDNA更为显著，这可能与RNA分子在体温条件下的结构特性有关。RNA分子更容易形成复杂的二级结构，从而更有效地与探针结合，提高检测的灵敏度。因此，DEMBA在检测RNA方面表现出更高的效率。

尽管DEMBA方法在实验中已经实现了对ssDNA和ssRNA的检测，但目前还无法进行定量分析。这是因为目标序列本身可能对探针的切割过程起到催化作用，而反应的进行受到多种因素的影响，包括酶的浓度和产物的种类。因此，定量分析仍然面临一定的技术挑战。未来的研究方向之一是优化探针结构和反应条件，以实现对目标序列浓度的精确测量。定量分析的实现对于DEMBA方法的广泛应用至关重要，尤其是在需要精确判断病原体载量的临床诊断中。

此外，我们还发现，在体温条件下，DEMBA探针的结构稳定性受到一定限制。即使在目标序列存在的情况下，探针也可能发生非特异性的切割或结构变化，从而影响检测结果的准确性。因此，进一步优化探针的设计，提高其在体温条件下的稳定性，是提升检测性能的关键。例如，可以通过调整探针的长度、序列排列或引入特定的稳定结构来增强其在温和条件下的功能表现。

本研究的成功实施表明，基于体温的内切酶依赖性分子信标检测法具有广阔的前景。该方法不仅能够满足现场快速检测的需求，还能够减少对复杂设备的依赖，从而降低检测成本和提高操作的便捷性。特别是在应对突发传染病和大规模筛查场景时，DEMBA方法可以作为一种高效的替代方案。然而，目前该技术仍处于初步探索阶段，需要在多个方面进行进一步优化和验证，包括探针结构的稳定性、反应条件的精确控制以及检测灵敏度的提升。

未来，DEMBA方法有望被应用于更广泛的领域，如点对点检测（POCT）、现场快速诊断以及环境样本的检测。通过与现有检测技术的结合，例如侧流检测条、智能手机读数系统或其他便携式设备，DEMBA可以进一步拓展其应用范围，实现更加智能化和自动化的检测流程。此外，随着对限制性内切酶在不同温度条件下的研究深入，DEMBA方法还可以被扩展至更多种类的内切酶，从而适应不同类型的核酸检测需求。

总的来说，本研究提出了一种基于体温的内切酶依赖性分子信标检测法，为实现快速、简便、高效的核酸检测提供了新的技术路径。通过结合荧光检测和侧流条带分析，该方法能够在无专业设备的情况下完成检测，具有重要的应用价值。尽管目前还存在一些技术挑战，如探针的稳定性、定量分析的实现以及背景信号的控制，但这些问题都可以通过进一步的实验优化和结构设计来逐步解决。随着研究的深入，DEMBA方法有望成为未来核酸检测领域的重要工具之一。