无散射紫外-可见光谱技术：用于复杂RNA纳米颗粒制剂中RNA的准确高效定量

《Analytical Chemistry》：Scatter-Free UV–Visible Spectroscopy for Accurate and Precise RNA Quantification in Complex RNA Nanoparticle Formulations

RNA纳米颗粒（NP）的RNA浓度测定面临挑战，传统荧光法依赖NP破坏。本研究开发了散射-free吸收光谱（SFAS），通过石英比色皿和积分球消除光散射干扰，结合线性去卷积算法分离NP成分与RNA的吸光度。实验测试了脂质、聚合物-脂质杂交、树状聚合物和环糊精NP四种体系，并与RiboGreen、SYTO 9荧光法对比。结果显示，SFAS的RNA浓度测定值（13.38-18.59 μg/mL）与理论值偏差<10%，显著优于荧光法的低估结果（RiboGreen：8.79-16.81 μg/mL，SYTO 9：9.65-17.27 μg/mL）。尤其对难以破坏的环糊精NP（CD）和聚合物-脂质杂交NP（PH），SFAS准确度提升达48%，且无需高温处理或表面活性剂。分子动力学模拟显示，SFAS的积分球结构使散射光返回比色皿，有效消除粒径干扰。该技术突破了传统荧光法依赖NP破坏的限制，为RNA疗法载体开发提供了可靠的质量控制工具。

　　RNA药物在治疗多种疾病方面展现出巨大的潜力。它们的临床应用依赖于复杂的纳米颗粒（NPs）制剂，这些制剂由多种生物材料构成。然而，对这类纳米颗粒中总RNA浓度的精确测量一直是一个挑战。传统的方法往往需要昂贵、低通量的手段，或者依赖于荧光染料如RiboGreen的使用，而这些方法通常需要对纳米颗粒进行有效破坏，才能释放RNA以便检测。本研究评估了一种名为“无散射吸收光谱法”（Scatter-Free Absorption Spectroscopy, SFAS）的UV/可见光谱技术，该技术能够去除纳米颗粒成分的光散射干扰，从而实现对完整纳米颗粒中RNA浓度的准确测量。

为了验证SFAS的可靠性，我们选择了几种具有不同物理化学特性的RNA制剂，包括脂质纳米颗粒（LNP）、聚合物与脂质混合纳米颗粒（PH）、树枝状聚合物-脂质混合纳米颗粒（DH）以及环糊精纳米复合物（CD）。这些制剂在RNA测量过程中可能会产生干扰，因此特别具有挑战性。我们将SFAS获得的数据与使用RiboGreen和SYTO 9这两种荧光染料的检测方法进行对比。RiboGreen主要用于检测游离RNA，而SYTO 9则用于检测封装在纳米颗粒中的RNA。研究结果显示，SFAS在所有制剂中都表现出更高的准确性和重复性，尤其是在那些对破坏不敏感的制剂中。SFAS对纳米颗粒的组成和测量条件影响较小，而RiboGreen和SYTO 9则容易受到这些因素的影响。

UV/可见光谱法是一种简单且广泛使用的RNA浓度测量方法，其原理是基于RNA在260 nm波长处对紫外光的吸收。然而，这种方法在测量封装在纳米颗粒中的RNA时受到纳米颗粒散射效应的干扰。SFAS通过引入一个集成球装置来消除这种散射效应，从而得到一个无干扰的吸收光谱。该方法不仅提高了测量的准确性，还允许样品在测量后继续用于其他分析，增强了方法的可持续性。尽管SFAS最初在含有可离子化脂质（SM-102）的LNP中进行了评估，但许多新兴的纳米颗粒制剂具有不同的化学组成、辅料构成以及粒子大小和形态，这些都可能影响UV光谱法的测量结果。因此，我们应用了线性解卷积技术，以分离纳米颗粒成分的吸收信号与RNA的真实信号，从而实现更精确的RNA浓度测定。

本研究中，我们选择了三种代表性生物材料，包括聚合物、树枝状分子和环糊精，这些材料在体外和体内均表现出高效的RNA递送能力。为了进一步验证SFAS的鲁棒性，我们还选择了对去垢剂如Triton X-100破坏不敏感的材料，这些材料可能对RiboGreen检测产生干扰。此外，我们还关注了那些含有芳香基团的材料，因为这些基团可能会在260 nm附近产生吸收，从而影响RNA的测量。在这些材料中，我们选择了含有芳香基团的Janus树枝状分子作为DH制剂的代表。我们还使用了SM-102作为对照，因为该制剂在SFAS中表现出最低的吸收干扰，并且是具有临床意义的LNP制剂。

在方法学部分，我们详细描述了纳米颗粒的制备过程以及RNA浓度的测量方法。PH和DH纳米颗粒通过微流体混合器或微孔板搅拌器进行制备，而CD纳米颗粒则通过与环糊精混合来形成。所有纳米颗粒样品在测量前都被稀释至5 μg/mL，并使用CloudSpec仪器进行吸收光谱测量。为了消除散射效应，我们采用了一个集成球装置，该装置能够有效捕获和扩散散射光。通过线性解卷积方法，我们能够分离纳米颗粒成分的吸收信号，并计算出RNA的真实浓度。这种方法在多个纳米颗粒批次中表现出良好的重复性和精确性。

在结果部分，我们展示了SFAS在不同纳米颗粒制剂中的表现。对于PH、DH和LNP制剂，SFAS测得的RNA浓度与预期值相符，而RiboGreen和SYTO 9则存在较大的偏差。特别是对于CD制剂，RiboGreen的测量结果显著低于预期值，这表明该方法在破坏纳米颗粒方面存在不足。通过引入加热步骤，我们尝试提高RiboGreen的RNA释放效率，但这种方法在某些制剂中效果有限。相比之下，SYTO 9在PBS缓冲液中表现出更好的一致性，但其测量结果仍受到缓冲液组成、RNA类型和温度等因素的影响。

讨论部分进一步分析了SFAS与其他方法的优劣。SFAS通过吸收光谱法实现了对RNA的无干扰测量，避免了传统荧光方法中由于纳米颗粒破坏不完全而导致的误差。此外，SFAS对纳米颗粒的组成和测量条件不敏感，使得其在多种复杂制剂中都能保持较高的准确性和重复性。而RiboGreen和SYTO 9则需要依赖纳米颗粒的破坏，这在某些情况下可能不现实或不可靠。因此，SFAS作为一种无破坏性、高精度的RNA浓度测量方法，为纳米颗粒研究提供了更可靠的选择。

结论部分总结了本研究的主要发现。SFAS在多种纳米颗粒制剂中均表现出优越的性能，特别是在那些对破坏不敏感的制剂中。该方法不仅能够准确测量RNA浓度，还能够避免光散射干扰，提高测量的可靠性。此外，SFAS的线性解卷积技术使得其能够有效分离纳米颗粒成分的吸收信号，从而实现更精确的RNA定量。虽然SYTO 9在某些情况下表现优于RiboGreen，但其对缓冲液、温度和RNA序列的敏感性限制了其广泛适用性。综上所述，SFAS作为一种简单、高效且可靠的RNA定量方法，为纳米颗粒药物的开发和研究提供了重要的工具。