桑树青枯病菌特异性双重PCR检测技术的开发与应用

《Chemical and Biological Technologies in Agriculture》：Development of duplex PCR targeting RpmTEs and phcA genes for rapid and simultaneous detection of Ralstonia pseudosolanacearum in mulberry and other crops

为解决桑树青枯病病原菌（Ralstonia pseudosolanacearum Mori, RPM）快速精准检测的难题，本研究开发了一种基于转座酶基因RpmTEs和毒力调控基因phcA的双重PCR（dPCR）检测技术。该技术可特异性识别RPM及其他R. pseudosolanacearum菌株，灵敏度达1×104 CFU/mL，在田间样本检测中表现优异，为作物细菌性青枯病的早期诊断与防控提供了高效工具。

　　

在全球范围内，细菌性青枯病（Bacterial Wilt）是一种毁灭性的土传病害，每年给农业生产造成超过10亿美元的经济损失。其病原菌——青枯雷尔氏菌复合种（Ralstonia solanacearum Species Complex, RSSC）具有广泛的寄主范围，可侵染超过400种植物，包括番茄、马铃薯、烟草等重要经济作物。桑树作为蚕桑产业的核心植物，同样面临青枯病的严重威胁。自196年在广东首次报道以来，该病害已蔓延至中国南方多个蚕区，成为制约桑树生产的瓶颈问题。

传统诊断方法依赖病原菌分离培养和生化鉴定，耗时长、主观性强，且难以区分RSSC内部的高度遗传多样性。尽管PCR等分子技术已被应用于RSSC检测，但现有方法无法同时特异性识别桑树来源的R. pseudosolanacearum Mori（RPM）与其他寄主来源的菌株。这种检测盲区导致田间病原菌监控效率低下，阻碍了针对性防控策略的实施。

为解决这一难题，研究人员开发了一种RPM特异性的双重PCR（duplex PCR, dPCR）检测技术。该技术靶向两个关键基因：RPM特有的IS5家族转座酶基因RpmTEs（GenBank: SAMN37721522）和RSSC保守的毒力调控基因phcA（GenBank: AL646052.1）。通过优化引物浓度、退火温度和循环次数，最终确定最佳反应体系为：RpmTEs-1F/R引物0.25 μM、phcA-1F/R引物0.5 μM，退火温度63°C，循环30次。验证显示，该技术对RPM和R. pseudosolanacearum的检测灵敏度分别达到1 pg/μL DNA和10 pg/μL DNA，且能有效排除Enterobacter sp.、Klebsiella sp.等非目标菌株的干扰。

在田间样本验证中，该技术对268份疑似病样的检测率（RPM 64.8%，非桑树RSSC 46.9%）显著高于传统TTC培养法，证实其在实际应用中的高效性。

关键技术方法

研究利用来自9种寄主（包括桑树、番茄、花生等）的198株R. pseudosolanacearum菌株及22株非目标菌株，通过正交实验优化dPCR反应体系；采用十倍梯度稀释法评估检测限；通过混合病原菌实验验证抗干扰能力；最终利用广东、广西采集的268份田间病样进行实用性验证，并与16S rDNA测序结果对比。

结果

1. 引物特异性评估

通过比较RpmTEs-1F/R、phcA-1F/R与已报道引物MG67-F/R、AU759f/AU760r的性能，发现新设计引物的检测准确率分别提高2.27%和5.00%，且无非特异性扩增。

2. 反应体系优化

正交实验确定最佳引物浓度为RpmTEs-1F/R 0.25 μM、phcA-1F/R 0.5 μM；退火温度63°C时可平衡扩增效率与信号强度；30次循环可最大限度减少非特异性扩增。

3. 检测灵敏度与抗干扰性

dPCR可稳定检测低至1×10⁴ CFU/mL的菌悬液，且在目标菌与非目标菌混合比例达1:10²时仍保持特异性。

4. 田间样本验证

在268份田间病样中，dPCR对RPM和非桑树RSSC的检测率均高于传统方法，且与16S rDNA测序结果高度一致。

结论与意义

本研究建立的RPM-dPCR技术首次实现了对桑树青枯病菌的高特异性、高灵敏度检测，克服了现有方法在区分RPM与其他RSSC菌株时的局限性。该技术不仅为桑树细菌性青枯病的早期诊断提供了可靠工具，还可扩展至其他作物的病原菌监测，对实现精准防控、减少农药滥用具有重要意义。未来通过进一步优化引物设计并整合便携式检测设备，有望在田间实时监测中发挥更大价值。