从采样到膜过滤及DNA提取，水中细菌无培养检测的最新方法：一项系统综述

《MicrobiologyOpen》：The Latest Practices in Culture-Free Detection of Bacteria in Water, From Sampling to Membrane Filtration and DNA Extraction: A Systematic Review

本文系统综述了水体无培养细菌DNA检测的多种方法，比较了采样、过滤和DNA提取的技术差异，发现0.22微米PES滤膜和商业试剂盒最常用，并强调了标准化方法的重要性。

　　近年来，随着分子生物学技术的快速发展，水体中细菌DNA的检测方法得到了广泛关注。然而，这一领域仍然缺乏统一的标准，导致研究者在实验设计和数据处理上存在较大差异。本文旨在对现有的水体细菌DNA提取方法进行系统回顾，评估其适用性和优缺点，并为环境分子生物学研究提供指导。通过综合分析，本文揭示了多种方法的使用情况，包括采样、过滤、预处理和DNA提取等步骤，同时指出了不同方法之间的差异及其对研究结果的影响。

### 采样方法

在采样阶段，多数研究使用了简单的无菌容器（如聚丙烯或玻璃瓶）来收集水样，且采集量多为1000 mL。这可能是因为容器便于携带和操作，适合大多数研究场景。然而，一些研究使用了专门的采样设备，如水平水样采集器或泵，以获取更深层或长时间的水样。这些设备的优点在于能够获取更深层水体的样本，或在长时间内持续采集，从而提高样本的代表性。然而，它们的使用需要特定的条件，例如电源支持，这在野外或偏远地区可能是一个限制。

### 过滤方法

在过滤阶段，研究人员主要使用了膜过滤技术。根据文献，膜过滤材料多种多样，包括混合纤维素酯（MCE）、聚醚砜（PES）、纤维素硝酸盐、纤维素乙酸盐、聚碳酸酯、多孔玻璃、玻璃纤维、尼龙、乙烯基和氧化铝等。膜孔径的大小是选择过滤材料时的重要因素，大多数研究选择了0.22 μm的膜，因为这种孔径可以有效保留细菌细胞。然而，一些研究使用了较大的孔径，以去除较大的颗粒物或藻类细胞，从而避免膜堵塞。这表明，膜孔径的选择需根据水体的特性进行调整，以确保最佳的过滤效果。

### 预处理步骤

在提取DNA之前，许多研究采用了预处理步骤以提高提取效率。这些预处理方法包括酶解（如蛋白酶、蛋白酶K、溶菌酶和溶葡萄球菌素）和物理方法（如珠磨、离心、涡旋、超声波处理、加热和冻融循环）。酶解方法通常与提取试剂盒中的裂解缓冲液结合使用，以增强细胞裂解效果。物理方法则通过机械力破坏细胞壁，从而释放DNA。值得注意的是，某些研究发现，预处理步骤可能会影响DNA的完整性和提取效率，因此需要谨慎选择。

### DNA提取方法

DNA提取方法主要包括商业试剂盒和实验室自制方法。商业试剂盒因其标准化、操作简便和兼容性强而受到广泛欢迎，尤其是用于定量PCR（qPCR）和16S rRNA分析。然而，某些试剂盒可能无法有效提取具有强细胞壁的细菌，或者对某些特定细菌群体的提取效果不佳。实验室自制方法则提供了更大的灵活性，但需要更多的时间和优化，同时可能涉及有毒试剂的使用，增加了实验的风险。因此，选择合适的提取方法应根据研究目的、样本类型和实验条件综合考虑。

### 方法的标准化与适用性

目前，水体细菌DNA提取方法存在较大的异质性，这使得数据的可比性和可重复性受到影响。为了提高研究的透明度和可比性，建议在文章的方法部分详细描述采样地点、深度、水体类型、样本量、使用的容器、过滤膜的类型和孔径、真空系统、提取试剂盒的名称以及任何预处理步骤。此外，应明确说明提取方法的适用性和局限性，以帮助其他研究者选择合适的实验方案。

### 未来发展方向

未来的研究应致力于开发更加标准化、灵活且适用于现场应用的提取方法。随着技术的进步，出现了许多便携式DNA提取平台和与便携式测序设备的集成，这为现场检测提供了新的可能性。同时，开发适用于复杂水体的通用提取方案，也有助于提高研究的效率和准确性。此外，标准化的报告格式和数据收集方法将有助于促进研究的可重复性和跨研究的比较分析。

### 结论

本文总结了当前用于从水体中提取细菌DNA的方法，强调了不同步骤之间的相互作用和对最终结果的影响。虽然存在多种方法，但选择合适的采样和提取技术仍需根据研究的具体需求进行调整。未来的研究应注重方法的标准化和优化，以提高数据的可靠性和实用性，从而推动环境微生物学的发展。