由硫化物还原作用诱导的、吸附在铁纳米颗粒上的质粒携带抗生素抗性基因的释放及其细菌转化活性

《Journal of Environmental Sciences》：Release and bacterial transformation activity of plasmid-borne antibiotic resistance genes adsorbed on iron nanoparticles as induced by sulfide reduction

本研究探讨硫化物诱导的Fe(OH)?和FeOOH纳米颗粒（IONPs）还原溶解对吸附外源抗生素抗性基因（eARGs）释放及转化活性的影响。实验表明，在腐殖酸（PPHA）存在下，硫化钠浓度从0.05增至5 mmol/L时，IONPs吸附的pUC19质粒释放率分别从0.8%和0.6%增至91%和75%；但释放质粒的转化活性随硫化钠浓度升高而显著降低，主要归因于硫化物诱导的质粒失活反应。腐殖酸在防止释放质粒重新吸附至IONPs和促进硫化物向质粒转移电子之间起双重作用。研究结果揭示了硫循环与eARGs环境行为间的复杂关联，对评估无氧环境中抗生素抗性基因的传播风险具有重要意义。

　　在无氧环境中，溶解态硫化物广泛存在于土壤和沉积物中，并且能够迅速还原常见的铁（氢氧化物）纳米颗粒（IONPs）。这些IONPs具有强大的吸附能力，能够吸附胞外抗生素抗性基因（eARGs），从而抑制其转化活性。本研究探讨了硫化物诱导的IONPs还原溶解是否以及在多大程度上影响了吸附在IONPs上的eARGs的释放和转化潜力。随着Na?S浓度从0.05 mmol/L增加到5 mmol/L，在存在Pahokee Peat Humic Acid（PPHA，10 mg C/L）的情况下，吸附在赤铁矿纳米颗粒（HNPs）和针铁矿纳米颗粒（GNPs）上的质粒释放比例分别从0.8%和0.6%上升到91%和75%。然而，在没有PPHA的情况下，无论Na?S浓度如何变化，均未观察到质粒的释放。值得注意的是，随着硫化物浓度的增加，释放的质粒对大肠杆菌（*E. coli* DH5α）的转化活性显著下降。这一现象主要归因于硫化物诱导的质粒失活反应。有趣的是，PPHA在调节释放质粒的转化活性方面发挥了双重且相反的作用：一方面，它作为加速剂，防止释放的质粒重新吸附到IONPs或新形成的FeS上；另一方面，它又作为抑制剂，促进硫化物向质粒的电子转移，加剧质粒的失活。考虑到硫化物在无氧环境中的普遍存在及其在铁循环中的关键作用，硫化物诱导的IONPs吸附eARGs的释放对评估eARGs的命运及它们向细菌的水平转移潜力具有重要意义。

硫化物（S2?和HS?）在硫的生物地球化学循环中扮演着关键角色，特别是在无氧环境中，如沉积物、淹水土壤和湿地（Canfield et al., 2010; Fakhraee et al., 2024）。在自然环境中，硫化物主要通过硫酸盐还原菌（SRB）介导的微生物硫酸盐还原过程以及硫化有机物的厌氧分解产生（Dyksma and Pester, 2023; Zhou et al., 2023; Raven et al., 2021; Wei et al., 2023）。在沉积物-水界面，硫化物的迁移受到氧化还原梯度波动、微生物活动和有机质成岩作用的驱动（Han et al., 2015; Qian et al., 2023; Zhou et al., 2024）。一旦硫化物进入上覆水体，它们可能通过多种途径被氧化，例如与溶解氧、其他氧化剂（如硝酸盐和铁/锰氧化物）发生化学反应（Eldridge and Farquhar, 2018; Figueroa et al., 2023; Wang et al., 2019; Yang et al., 2022），或者由硫氧化细菌引发的生物途径（Liau et al., 2022; Yang et al., 2024）。这些过程对于将硫化物转化为更稳定的形态，如地表环境中形成的硫酸盐（SO?2?）至关重要。

铁（氢氧化物）氧化物，如赤铁矿（α-Fe?O?）、针铁矿（α-FeOOH）、磁铁矿（Fe?O?）和纤铁矿（5Fe?O?·9H?O），是土壤和沉积物中的关键成分（Gareev, 2023; Hochella et al., 2019; Kappler et al., 2021）。它们广泛分布于自然环境中，并在铁的生物地球化学循环中发挥重要作用。铁（氢氧化物）纳米颗粒（IONPs）因其小尺寸而具有较高的比表面积和增强的吸附能力，这种纳米尺度特性使它们在许多氧化还原反应中表现出更高的反应性和催化活性（Chen et al., 2021; Yang et al., 2025）。IONPs在环境中具有重要影响，特别是在促进抗生素抗性基因（ARGs）的水平传播方面。

抗生素抗性基因（ARGs）的广泛传播对全球公共卫生构成了重大威胁（Larsson and Flach, 2022; Liu et al., 2024; Zheng et al., 2022; Zhu et al., 2025）。其中，胞外抗生素抗性基因（eARGs）尤为关注（Dong et al., 2019; Zarei-Baygi and Smith, 2021; Zhou et al., 2023）。这些eARGs主要来源于微生物细胞的裂解和释放，通过自然转化进入受体细菌（Sommer et al., 2017; Thomas and Nielsen, 2005）。这一过程在水体、土壤和沉积物环境中普遍存在，极大地促进了抗生素抗性的扩散（Mao et al., 2014; Wang et al., 2025; Zhu et al., 2023）。此外，eARGs在土壤和沉积物中的吸附，如金属氧化物、黏土矿物和腐殖质，显著限制了它们被细菌摄取的能力（Chowdhury et al., 2022; Hu et al., 2020; Hu et al., 2019; Huang et al., 2023）。然而，这种吸附也保护了eARGs免受胞外脱氧核糖核酸酶（DNases）和微生物代谢的降解（Cai et al., 2006; Deng et al., 2024），从而增强了其环境持久性，并在有利条件下创造了后续自然转化的潜在机会。除了这些天然的吸附剂，近年来研究发现，生物炭作为一种工程化的碳质材料，对质粒携带的eARGs表现出极强的吸附能力，并显著抑制其水平转移活性（Fang et al., 2022, 2025; Gao et al., 2023）。

纳米尺寸的金属氧化物颗粒在促进eARGs的水平传播方面的作用日益受到重视。已有研究表明，纳米尺寸的Al?O?、CuO和CeO?等材料能够通过多种机制，如氧化应激诱导、膜损伤和SOS反应激活，显著促进接合和类似转导的过程（Ding et al., 2021; Qiu et al., 2012; Yu et al., 2020; Zhang et al., 2019）。这些发现突显了纳米颗粒在ARGs扩散中的关键作用。尽管之前的研究表明，IONPs在土壤中对eARGs具有极强的吸附亲和力和容量，这是因为eARGs中的磷酸基团在IONPs表面形成了非常强的内球配位（Feng et al., 2024; Hettiarachchi and Grassian, 2024; Schmidt and Martinez, 2017），但关于IONPs吸附的eARGs如何释放以及其水平转移潜力的路径和机制仍不明确。在我们之前的研究（Yi et al., 2024）中，我们发现携带ARGs的质粒在纳米尺寸赤铁矿上吸附后，能够在微生物还原溶解过程中被释放，并且释放后的质粒仍能保持其对自然转化的活性。然而，关于无机硫化物还原对吸附在IONPs上的eARGs命运和水平转移的影响尚未进行系统研究。考虑到硫化物在无氧土壤和沉积物中的广泛分布及其在还原条件下驱动铁循环的关键作用（Bastami et al., 2024; Zhang et al., 2023），有必要探讨硫化物诱导的Fe(III)还原是否能够释放吸附在IONPs上的eARGs，进而促进其可能的自然转化。

本研究旨在验证以下假设：（1）硫化物诱导的IONPs还原溶解显著促进吸附的eARGs的释放；（2）从IONPs释放的eARGs仍保持较高的生物活性以实现水平基因转移；（3）eARGs的释放程度及其后续的水平基因转移受到表面介导和水相反应的共同调控。具体而言，我们研究了两种典型的IONPs，即赤铁矿纳米颗粒（HNPs）和针铁矿纳米颗粒（GNPs），在存在或不存在腐殖酸的情况下，硫化物诱导的还原溶解如何影响携带青霉素抗性基因的质粒pUC19的释放。我们系统地探讨了硫化物浓度对两种IONPs上吸附质粒的释放及其后续水平转移的影响机制。通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）对质粒pUC19的吸附和释放进行量化分析，同时使用模型受体细菌株*E. coli* DH5α评估释放质粒的转化活性，并通过凝胶电泳分析评估质粒的结构变化。本研究旨在填补关于铁-硫循环与eARGs命运之间复杂关系的知识空白，特别是在硫化物诱导的Fe(III)还原强烈的环境中。

在自然环境中，IONPs通常作为电子受体，并可能被无机还原剂（如硫化物）或铁还原细菌还原（Melton et al., 2014）。先前的研究表明，硫化物诱导的IONPs还原溶解可能导致吸附的磷酸和砷酸盐离子的脱附和释放（Yin et al., 2025; Zhang et al., 2022）。IONPs还可能作为eARGs的重要储存库，因为其大比表面积和高结合能力使得eARGs能够稳定地吸附在其表面。在无氧条件下，硫化物能够有效还原IONPs，进而导致其溶解，释放出吸附的eARGs。这一过程不仅影响了铁的生物地球化学循环，还可能对环境中抗生素抗性基因的传播产生深远影响。

此外，硫化物诱导的Fe(III)还原能够同时释放吸附在IONPs上的重金属（如As、Hg、Cr和Zn）和阴离子（如磷酸盐），从而增强它们的迁移性和生物可利用性（Guo et al., 1997; Li et al., 2023; Wilfert et al., 2020）。因此，硫化物诱导的Fe(III)还原在调控氧化还原动态、元素循环以及环境污染物的命运方面具有多重作用。然而，这种作用的机制和影响仍需进一步深入研究。

在本研究中，我们发现PPHA的存在对硫化物诱导的IONPs还原溶解过程具有显著影响。在存在PPHA的情况下，随着Na?S浓度的增加，质粒的释放比例显著提高，而PPHA的缺失则导致质粒无法释放。这一现象表明，PPHA在硫化物诱导的IONPs还原过程中可能起到了重要的媒介作用。PPHA不仅能够促进硫化物与IONPs的反应，还可能通过改变溶液的化学环境，影响质粒的吸附和释放行为。此外，PPHA还可能通过其自身的化学性质，如高分子量和复杂的官能团结构，与质粒发生相互作用，从而改变其生物活性。

从研究结果来看，硫化物浓度的增加不仅促进了Fe(II)的生成，还显著提高了质粒的释放比例。然而，释放的质粒在转化活性方面表现出下降趋势，这主要归因于硫化物诱导的质粒失活反应。PPHA在这一过程中表现出双重作用，既防止了质粒重新吸附到IONPs或新形成的FeS上，又通过促进电子转移加剧了质粒的失活。这种双重作用机制表明，PPHA在硫化物诱导的IONPs还原过程中可能起到了重要的调节作用。

本研究的发现对于理解eARGs在硫化物环境中的命运具有重要意义。在无氧条件下，硫化物的广泛存在使得IONPs吸附的eARGs更容易被释放，从而增加了其水平转移的可能性。然而，硫化物诱导的质粒失活反应可能会显著降低其转化活性，从而影响其在环境中的传播能力。因此，在评估eARGs的命运和水平转移潜力时，必须充分考虑硫化物的存在及其对IONPs还原溶解过程的影响。

此外，本研究还揭示了腐殖酸在硫化物诱导的IONPs还原过程中的复杂作用。在存在PPHA的情况下，质粒的释放比例显著提高，而PPHA的缺失则导致质粒无法释放。这表明，PPHA在促进质粒释放的同时，也可能通过其自身的化学特性，如高分子量和复杂的官能团结构，影响质粒的吸附和释放行为。PPHA的这种双重作用可能与其在溶液中的化学行为有关，例如其作为电子传递介质的能力，以及其与IONPs和硫化物之间的相互作用。

在实际环境中，硫化物的存在可能会影响IONPs的稳定性，进而影响eARGs的吸附和释放行为。因此，在评估eARGs的环境行为时，必须考虑硫化物的浓度及其与IONPs之间的相互作用。此外，PPHA的广泛存在也可能对eARGs的传播产生重要影响，尤其是在硫化物诱导的IONPs还原过程中，PPHA可能通过其自身的化学特性，如高分子量和复杂的官能团结构，影响质粒的吸附和释放行为。

本研究的发现为理解eARGs在无氧环境中的命运提供了新的视角。在硫化物诱导的IONPs还原过程中，eARGs的释放不仅受到硫化物浓度的影响，还受到腐殖酸等有机质的影响。因此，在评估eARGs的环境行为时，必须综合考虑多种因素，如硫化物浓度、有机质的存在以及IONPs的类型。这些因素可能共同作用，影响eARGs的吸附、释放及其后续的水平转移能力。

综上所述，硫化物诱导的IONPs还原溶解过程在促进eARGs释放和水平转移方面具有重要作用。然而，这一过程也伴随着质粒的失活，这可能对eARGs的传播能力产生负面影响。因此，在无氧环境中，硫化物的存在和浓度变化可能对eARGs的命运产生复杂的影响。未来的研究需要进一步探讨这些机制，以更好地理解eARGs在不同环境条件下的行为，并为环境管理和污染控制提供科学依据。