《Journal of Microbiological Methods》：Suppression/competition PCR: A novel method to minimize unwanted amplicons in metabarcoding, with applications to parasite detection in fecal samples
编辑推荐：
本研究开发了一种新型代谢组测序方法，通过长读纳米孔测序技术扩增18S rRNA基因V1-V8区域，并设计Suppression/Competition PCR抑制非目标DNA扩增。该方法将真菌和植物序列占比从64%降至1%以下，使寄生虫检测覆盖率从36%提升至98%以上，成功检测到隐孢子虫、弓形虫等7种重要寄生虫。
贾斯汀·马克·卡帕尼（Justin Mark Carpani）| 约翰·R·巴塔（John R. Barta）| 丽贝卡·A·盖伊（Rebecca A. Guy）
加拿大公共卫生署国家微生物实验室，地址：110 Stone Road West, Guelph, ON N1G 3W4, 加拿大
摘要
宏条形码技术被广泛用于检测粪便样本中的微生物，但其有效性常常受到大量非目标DNA共扩增的限制。在这项研究中，开发了一种新的宏条形码检测方法，能够扩增几乎完整的18S rRNA基因片段，适用于长读长纳米孔测序，从而提高了分类学分辨率。引物经过优化，以最大化检测寄生虫的分类单元，同时最小化细菌和古菌序列的非目标扩增，从而提高了检测的特异性。在临床粪便样本中，该18S宏条形码方法表现良好，能够检测到具有临床意义的寄生虫。然而，对有蹄类动物粪便样本的分析显示，在许多样本中，真菌和植物序列的数量远超过其他真核生物分类单元，这阻碍了低丰度原生动物和蠕虫寄生虫的检测。为了解决这个问题，研究人员开发了一种称为“抑制/竞争PCR”（Suppression/Competition PCR）的新方法，该方法可以选择性减少不需要的DNA的扩增。这种方法将真菌和植物序列的占比降低了99%以上，使得其他分类单元的序列占总序列的98%以上，而最初仅为36%。使用这种新开发的宏条形码方法，无论是标准配置还是抑制/竞争配置，都能从多种宿主物种的粪便DNA提取物中检测到感兴趣的寄生虫，如隐孢子虫（Cryptosporidium）、卡氏环孢子虫（Cyclospora cayetanensis）、芽囊原虫（Blastocystis）、肠阿米巴（Entamoeba）、艾美耳球虫（Eimeria）、钩虫（Ancylostoma）和弓形虫（Toxocara），证明了其广泛的适用性。
引言
随着全球气候的快速变化，野生动物的迁徙模式和栖息范围也在发生变化，增加了人类与野生动物之间的互动频率。这些变化可能导致原生动物和蠕虫寄生虫进入新的地区，并传播给未接触过这些寄生虫的人类和动物群体。为了监测这些变化，需要可靠的分子检测方法来识别和追踪受影响区域的生物。宏条形码技术与下一代测序（NGS）相结合，可以进行广泛的分类学调查，广泛应用于微生物组研究、生物多样性监测和病原体检测（Gevers等人，2012年；Kim等人，2022年；Pédron等人，2020年）。
传统的宏条形码技术通常针对小亚基rRNA基因中的短而高度可变区域进行检测，这是由于测序技术的限制（Kounosu等人，2019年）。然而，长读长纳米孔测序技术可以研究更长的目标序列，从而提高分类学分辨率，并更准确地识别真核生物分类单元（Huggins等人，2023年）。粪便样本对于肠道寄生虫的监测尤为重要，但它们通常含有高水平的非目标DNA，如植物、真菌和宿主序列，这些成分可能会掩盖低丰度的病原体DNA（Elbrecht等人，2017年；Pascoal等人，2020年）。在细菌宏条形码研究中也遇到了类似的问题，即优势分类单元或宿主来源的序列可能会掩盖稀有但生物学上重要的生物（Deissová等人，2023年；Lasa等人，2019年）。低丰度序列可能表明某些生物的浓度较低，或者可能是由于污染或测序错误造成的，因此更深入的测序对于准确可靠的鉴定至关重要（Kunin等人，2009年；Leray和Knowlton，2017年）。
通过培养富集微生物可以提高检测灵敏度，从而能够检测到低浓度的病原体，但这种方法仅适用于可培养的生物（Alain和Querellou，2009年；Gu等人，2020年；Miller等人，2019年）。历史上，许多寄生虫复杂的生命周期和严格的生长要求限制了体外培养技术的应用，导致用于肠道寄生虫研究的方法较少（Sutrave和Richter，2021年）。这些问题凸显了在复杂样本中减少非目标DNA扩增方法的迫切需求。
降低不需要的DNA序列的相对浓度可以使更多数据来源于目标生物，从而提高检测的限界。如Kounosu等人（2019年）所展示的，精心设计的引物可以限制不需要的DNA目标的扩增。然而，在目标基因中可能不存在仅扩增所需目标的引物结合位点，因此需要在特异性和分类学覆盖范围之间做出权衡。在本研究中，当使用所设计的几乎完整的18S宏条形码方法对有蹄类动物的粪便样本进行检测时，遇到了高水平的真菌和植物序列，因此需要采用替代方法来确保目标分类单元的检测。为此，研究人员开发并评估了一种名为“抑制/竞争PCR”的新宏条形码方法。
部分内容
DNA提取物
我们使用了Enteric Protozoa Genomic DNA Panel MP-14 ?（ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）作为测序和生物信息学分析的正对照。该试剂盒包含来自十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis）、隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）、人芽囊原虫（Blastocystis hominis）和溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）的DNA。这些DNA在-30°C下长期储存。
从安大略省公共卫生实验室获得了检测到隐孢子虫（Cryptosporidium）阳性的人类粪便样本，这些样本已获得健康研究伦理委员会的批准。
18S V1-V8检测方法的验证
使用标准宏条形码方法（表1）对商业DNA试剂盒中的样本进行了扩增，以评估理论上可以在计算机上扩增的生物是否也能在体外扩增。该方法成功扩增了隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）、人芽囊原虫（Blastocystis hominis）和溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）的DNA，且非特异性扩增较少。相比之下，十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis的DNA提取物产生了许多非特异性条带。
生物信息学流程的验证
为了评估生物信息学流程的有效性，我们对...
讨论
现有的宏条形码引物并不适合使用长读长纳米孔测序技术来检测多种原生动物和蠕虫寄生虫，因为它们通常只针对少数几个高度可变区域（如V4-V6区域或V9区域），或者仅针对有限范围内寄生虫的分类单元的较大扩增子（Huggins等人，2023年）。本研究开发的新宏条形码方法能够扩增V1-V8区域的DNA。
结论
本研究介绍了一种新的宏条形码方法，专注于扩增对人类和动物健康有影响的原生动物和蠕虫寄生虫。通过利用纳米孔测序技术，该方法能够针对更长的条形码区域，从而提高分类学分辨率。值得注意的是，该方法不仅检测到了多种寄生虫分类单元，还提供了比使用较短扩增子时更深入的分类学信息，实现了多个寄生虫物种的鉴定。
CRediT作者贡献声明
贾斯汀·马克·卡帕尼（Justin Mark Carpani）：概念构思、数据整理、正式分析、实验设计、方法学研究、软件开发、数据可视化、初稿撰写及审稿编辑。约翰·R·巴塔（John R. Barta）：概念构思、项目监督、审稿编辑。丽贝卡·A·盖伊（Rebecca A. Guy）：概念构思、资金筹集、项目管理、监督、审稿编辑。
资金来源
本研究部分由加拿大政府通过“基因组研究与发展计划”（Genomics Research and Development Initiative）——“基因组适应与气候变化韧性项目”（GenARCC）（2022–2027年）资助。其余资金由加拿大公共卫生署提供。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
如果没有安托尼·科尔贝尔博士（Antone Corbeil，安大略省公共卫生部门）提供的人类粪便样本，以及简·哈姆斯博士（Jane Harms，育空环境部门）、蒂姆·杜蒙索博士（Bison Research Network，加拿大农业和农业食品部）、格雷戈里·威尔逊博士和大卫·布鲁因斯马博士（Parks Canada）以及克莱尔·M·贾丁博士（OVC，安大略省圭尔夫市）提供的野生动物粪便样本，这项工作将无法完成。
