《Molecular & Cellular Proteomics》：Identification of variants of the
MTR gene in patients with the
cblG inborn error of cobalamin metabolism diagnosed by somatic cell complementation analysis
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甲基叶酸同型半胱氨酸甲基转移酶（MTR）基因变异与cblG型维生素B12代谢障碍相关，本研究通过NGS和CNV分析29例患者发现39个新发及既往报道变异，其中c.3518C>T（8个等位基因）最常见，另有2个新突变及已确认的深内含子突变（各6个等位基因）。分子诊断需结合表型特征和功能验证，因体细胞互补分析应用减少导致部分患者基因型未明。
大卫·沃特金斯（David Watkins）| 凯特琳·扎卡里亚斯（Caitlin Zacharias）| 凯亚娜·阿尔巴比安-乌尔基利亚（Kyana Arbabian-Urquilla）| 克里蒂卡·拉古帕蒂（Krithika Ragupathi）| 布莱恩·M·吉尔菲克斯（Brian M. Gilfix）| 丹尼尔·希门尼斯（Daniel Jimenez）| 纳塔西亚·阿纳斯塔西奥（Natascia Anastasio）| 让-巴蒂斯特·里维埃尔（Jean-Baptiste Rivière）| 大卫·S·罗森布拉特（David S. Rosenblatt）
加拿大蒙特利尔麦吉尔大学人类遗传学系
摘要
目的
维生素B12代谢的先天性缺陷cblG与编码蛋氨酸合成酶的MTR基因中的致病性变异有关。据报道，约有50名患者患有此病，目前已发表了54种可能致病的MTR基因变异。
方法
我们对29名cblG患者的基因组DNA进行了下一代测序和拷贝数变异分析，其中包括7名之前已进行过测序但结果不完整的患者。所有患者的诊断均通过体细胞互补分析确定。
结果
尽管未进行亲本相位分析，但我们在每位患者中都发现了两种潜在的致病性变异。共鉴定出39种不同的变异，其中24种在现有文献中尚未报道。最常见的致病性变异为c.3518C > T（8个等位基因）。之前已知的深内含子变异c.340-166 A > T和c.609 + 1088G > A也频繁出现（各6个等位基因）。在新发现的变异中，最常见的为c.2020C > T（p.Arg674Cys，3个等位基因）和c.1325C > A（p.Ala442Glu，2个等位基因）。
结论
通过了解互补状态，我们能够更准确地识别致病性或可能致病的变异。然而，随着体细胞检测方法的普及程度降低，这种信息的获取变得日益困难。
引言
cblG（MIM250949）是一种罕见的常染色体隐性遗传病，由MTR基因（MIM156570）中的致病性变异引起。MTR基因编码依赖钴胺素（维生素B12）的酶——5-甲基四氢叶酸：同型半胱氨酸甲基转移酶（EC2.1.1.13），也称为蛋氨酸合成酶[1,2]。目前已报告约50例患者，其中涉及54种不同的MTR基因变异[3][4][5][6][7][8][9][10][11][12][13][14][15]。患者通常在出生后的几个月内出现症状，但也存在发病较晚的病例。患者的特征包括巨幼红细胞性贫血以及多种神经系统表现，如发育迟缓、脑萎缩、小头畸形、肌张力低下、癫痫发作、脑电图异常、脑积水和中枢性共济失调[7]。此外，还可能出现血栓性微血管病变，表现为非典型溶血性尿毒综合征。
蛋氨酸合成酶负责将甲基从5-甲基四氢叶酸转移到同型半胱氨酸上生成蛋氨酸，这一过程通过酶结合的甲基钴胺素中间体完成。因此，蛋氨酸合成酶活性降低会导致同型半胱氨酸向蛋氨酸的转化减少，从而使血液和尿液中的同型半胱氨酸积累。循环中的蛋氨酸水平通常低于参考值或处于参考范围的低端。作为甲基供体的S-腺苷甲硫氨酸水平也会降低，进而影响多种甲基转移反应。蛋氨酸合成酶还催化5-甲基四氢叶酸向四氢叶酸的转化，其功能下降会减少用于嘌呤从头合成和脱氧尿苷酸向胸苷酸转化所需的叶酸衍生物的供应。这会导致核苷酸代谢受损，以及快速分裂细胞群体（包括骨髓血细胞前体）的增殖减缓。在cblG疾病中，另一种依赖钴胺素的酶——腺苷钴胺素依赖的甲基丙二酸-CoA突变酶的功能不受影响，因此通常不会出现甲基丙二酸血症。
在过去几十年中，我们通过体细胞互补分析研究了多名cblG患者，但其中许多患者的分子遗传学信息仍未完整记录。本文报告了对29名之前未进行过全面序列分析的cblG患者进行下一代测序和MTR基因序列变异分析的结果。对于那些发现可能影响剪接的细胞系或未鉴定出两种致病性变异的细胞系，我们进一步进行了分析。
患者信息
本研究选择了29名被诊断为cblG疾病的患者的成纤维细胞系。其中7名患者此前已在另一项研究中接受了Sanger测序[4]，另外22名患者是在该研究完成后提交的。所有患者的诊断均通过体细胞互补分析完成。除患者2（澳大利亚）和患者10外，其余患者均来自北美机构。
结果
本研究描述了对29名通过体细胞互补分析确诊为cblG的患者进行的下一代测序（NGS）和拷贝数变异（CNV）分析结果（表1）。对于6名NGS检测出剪接变异的患者以及1名仅通过NGS和CNV分析检测出单一杂合变异的患者，还进行了额外分析。所有29名患者的成纤维细胞均表现出5-甲基四氢叶酸摄取能力下降。
讨论
本研究的结果扩展了我们对cblG遗传基础的认识。新发现的致病性及可能致病的MTR基因变异使已知的致病性变异总数达到82种。目前报告的受影响患者人数已超过70人。这些变异包括错义变异、无义变异、插入突变、大段和小段缺失、剪接变异以及影响MTR蛋白剪接的内含子变异。
作者贡献声明
大卫·沃特金斯（David Watkins）：撰写、审稿与编辑、研究设计、概念构思。
凯特琳·扎卡里亚斯（Caitlin Zacharias）：研究。
凯亚娜·阿尔巴比安-乌尔基利亚（Kyana Arbabian-Urquilla）：研究。
克里蒂卡·拉古帕蒂（Krithika Ragupathi）：研究。
布莱恩·M·吉尔菲克斯（Brian M. Gilfix）：撰写、审稿与编辑、监督。
丹尼尔·希门尼斯（Daniel Jimenez）：数据分析。
纳塔西亚·阿纳斯塔西奥（Natascia Anastasio）：撰写、审稿与编辑、数据分析。
让-巴蒂斯特·里维埃尔（Jean-Baptiste Rivière）：研究、数据分析、概念构思。
大卫·S·罗森布拉特（David S. Rosenblatt）：撰写、审稿与编辑。
伦理声明
本研究已获得加拿大魁北克省蒙特利尔麦吉尔大学健康中心研究伦理委员会的批准。
资助声明
本研究得到了Hess B.和Diane Finestone实验室（为Jacob和Jenny Finestone纪念项目）的资助。
未引用参考文献
[21][22][23]
利益冲突声明
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢患者及其家属，以及将患者送至实验室进行诊断的医生。同时感谢Guillaume Bourque在长读长DNA测序方面的协助，以及Leah Ladores和Sina Yak在技术支持方面的贡献。
