基于全基因组特征和流行病学特征的实时定量RT-PCR新方法用于检测中国流行的PRRSV-1和PRRSV-2病毒株

《The Veterinary Journal》：Novel Real-Time Quantitative RT-PCR for Detection of PRRSV-1 and PRRSV-2 Strains Circulating in China: A Study Based on Whole-Genome Characteristics and Epidemiological Features

本研究基于中国流行PRRSV-1和PRRSV-2的基因组特征，开发了双联实时RT-qPCR检测法及两单联定量RT-PCR方法，通过优化和评估验证其高灵敏度、特异性及广谱包容性，并建立样本库完善阳性判定标准，结果显示新方法在病毒载量监测和亚型鉴别方面优于现有商业试剂盒。

　　近年来，随着研究的深入，人们发现中国境内猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的全基因组特性发生了显著变化，尤其是PRRSV-1和PRRSV-2。这些变化可能对传统的检测方法造成影响，导致检测结果的准确性下降。因此，本研究基于当前中国流行的PRRSV-1和PRRSV-2的全基因组特征，结合一个全面的基因序列数据库，对两种病毒的保守基因和特异性基因进行了识别，并据此设计了相应的引物和探针。经过系统的优化和评估，我们开发出一种双重实时逆转录定量聚合酶链反应（duplex real-time RT-qPCR）方法，用于同时检测和区分PRRSV-1与PRRSV-2，同时还开发了两种单重定量RT-PCR方法，用于测量每种病毒的病毒载量。为了评估双重实时RT-qPCR的性能，我们建立了一个全面的样本库，用于优化其阳性判定标准，评估其特异性与包容性，并将其检测能力与三种商业试剂盒进行比较。评估结果显示，当PRRSV-1和PRRSV-2两个通道均出现阳性结果时，定义为S形扩增曲线，且循环阈值（Ct值）≤36.0。而当出现S形扩增曲线，但Ct值大于36.0且不超过37.5时，则视为疑似阳性。当Ct值超过37.5时，则被归类为阴性。此外，该方法成功检测了多种PRRSV-1和PRRSV-2的毒株，能够准确区分两种病毒，并在区分能力上优于三种商业试剂盒。对于两种单重定量RT-PCR方法，通过使用携带多种PRRSV-1和PRRSV-2毒株感染的猪血清进行验证，结果显示在0天感染后（dpi）未检测到病毒RNA，而在3至21天dpi期间，成功量化了预期的病毒载量。总体来看，所开发的三种方法可作为检测、区分和量化中国境内流行的PRRSV-1和PRRSV-2毒株的有效工具。

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的传染病，主要表现为母猪的繁殖障碍和生长猪的呼吸道疾病，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。PRRSV是一种包膜的、正链的、单链RNA病毒，可以根据其基因组特征分为PRRSV-1和PRRSV-2两种类型，其中PRRSV-1的原型毒株是Lelystad病毒，而PRRSV-2的原型毒株是ATCC VR-2332。目前，已有多种检测PRRSV抗原和抗体的方法被开发和应用。例如，Marc-145细胞或猪肺泡巨噬细胞（PAMs）常用于免疫荧光检测（IFA）中，以分离和鉴定PRRSV。免疫层析试纸条因其操作简便、快速，被认为适合现场检测。酶联免疫吸附测定（ELISA）则因其经济性、速度和易用性，适用于大规模筛查。实时定量PCR（qPCR）技术，包括SYBR Green I和TaqMan探针方法，是一种高度自动化的技术，能够减少繁琐的操作步骤，提高检测的灵敏度和特异性。随着新型病原体的不断出现以及疫苗的快速发展，实时RT-qPCR已成为疫苗学、病原性评估和流行病学研究中的重要工具。

在中国，流行的PRRSV毒株具有多个亚型或谱系，快速的进化速率，频繁的重组事件以及复杂的重组模式。关于PRRSV-1，尽管目前在中国仅发现西方欧洲亚型I，但全基因组分析表明，中国PRRSV-1毒株的遗传多样性正在增加。这种多样性主要体现在亚群的扩展（从四个扩展到七个），复杂的重组模式的出现，以及来自不同或甚至同一猪场的完整基因组之间低的成对相似性。PRRSV-1在中国形成了流行模式，其中多个亚型共存，而BJEU06-1样PRRSV成为主要流行毒株。对于PRRSV-2，近期研究表明，谱系1和8在中国广泛流行，而谱系3、5和7的检测频率相对较低。谱系1的PRRSV进一步分化为多个分支，中国分离株主要集中在亚谱系L1A至L1C。谱系8的PRRSV由多个亚谱系组成，其中只有谱系8.7在中国流行。近期研究还表明，谱系8.7的PRRSV可以进一步分为亚谱系L8.7.1至L8.7.7。目前，中国PRRSV-1的检测频率、全基因组多样性和病原性均显著增加。同时，PRRSV-2谱系之间也出现了广泛的重组事件，伴随着多种变异毒株的持续出现。这些变化可能对传统检测方法造成影响，增加出现假阴性结果的风险。此外，PRRSV-1的流行趋势和增强的致病性也促使养猪场必须对其实施常规检测和鉴定。因此，迫切需要开发能够全面检测多种PRRSV亚型和亚谱系、准确区分PRRSV-1与PRRSV-2，并精确量化病毒载量的方法。

本研究基于中国境内流行的PRRSV-1和PRRSV-2的流行病学数据和全基因组特征，识别了两种病毒的保守基因和特异性基因区域。针对这些区域设计了相应的引物和探针，并建立了全面的样本库，用于评估设计的引物-探针组合的特异性和包容性。经过优化和评估后，我们开发出一种双重实时RT-qPCR方法（以下简称NA & EU双重RT-qPCR），用于同时检测和区分PRRSV-1与PRRSV-2。同时，我们还开发了两种单重定量RT-PCR方法（以下简称EU RT-qPCR和NA RT-qPCR），用于测量每种病毒的病毒载量。评估和比较分析表明，NA & EU双重RT-qPCR方法表现出高灵敏度、高特异性和广泛的包容性。此外，病毒血症检测结果表明，EU RT-qPCR和NA RT-qPCR方法能够准确监测PRRSV-1和PRRSV-2在血液样本中的病毒水平变化。

为了评估NA & EU双重RT-qPCR方法的特异性和包容性，并优化其阳性判定标准，我们建立了一个全面的样本库。该样本库整合了传统的RT-PCR与Sanger测序以及抗体检测技术。样本库分为两个部分：评估样本库和校准样本库。评估样本库包含六种不同的细胞培养适应型PRRSV-1病毒，代表西方欧洲亚型I；六种不同的细胞培养适应型PRRSV-2病毒，代表其他亚型。校准样本库则用于优化NA & EU双重RT-qPCR方法的阳性判定标准。通过系统分析样本库中的数据，我们能够明确阳性结果的判定条件，并评估该方法在实际应用中的表现。

病毒的遗传突变、重组事件和基因组缺失对传染病的防控构成了重大挑战。近年来的研究表明，PRRSV-1的检测率、遗传多样性和致病性显著增加。在中国，PRRSV-1毒株的流行趋势表明，其基因组特征发生了明显变化，这可能对传统的检测方法产生影响。同时，PRRSV-2的基因组也经历了频繁的重组和变异，导致其基因组结构更加复杂。这些变化不仅增加了病毒检测的难度，还可能导致检测结果的不确定性。因此，有必要开发新的检测方法，以应对这些挑战，提高检测的准确性和可靠性。

本研究通过建立全面的样本库，对NA & EU双重RT-qPCR方法进行了系统评估和优化。评估结果显示，该方法能够准确区分PRRSV-1与PRRSV-2，并且在区分能力上优于三种商业试剂盒。此外，该方法还表现出较高的灵敏度和包容性，能够检测到多种毒株。通过校准样本库的建立，我们进一步优化了阳性判定标准，使得检测结果更加可靠。校准样本库的构建不仅有助于提高检测的准确性，还能够为后续的检测方法提供标准化的参考。

在实际应用中，我们发现EU RT-qPCR和NA RT-qPCR方法能够准确监测PRRSV-1和PRRSV-2在血液样本中的病毒水平变化。这表明，这些方法不仅能够用于病毒的检测，还能够用于病毒载量的量化。通过使用携带多种PRRSV-1和PRRSV-2毒株感染的猪血清进行验证，我们确认了这些方法的有效性。验证结果显示，在0天感染后（dpi）未检测到病毒RNA，而在3至21天dpi期间，成功量化了预期的病毒载量。这表明，这些方法能够准确反映病毒在宿主体内的动态变化，并为病毒的传播和控制提供重要依据。

本研究的成果不仅为PRRSV的检测和区分提供了新的方法，还为病毒载量的量化提供了可靠的工具。这些方法能够有效应对中国境内PRRSV-1和PRRSV-2毒株的多样性变化，提高检测的准确性和效率。通过建立全面的样本库，我们能够系统评估这些方法的性能，并优化其应用条件。此外，这些方法的开发和验证也为未来的研究提供了重要的基础，有助于进一步理解PRRSV的流行趋势和遗传特征。

在实际应用中，这些方法可以广泛用于猪场的日常检测，为疾病的防控提供科学依据。通过实时监测病毒的水平变化，可以及时发现疫情，并采取相应的防控措施。此外，这些方法的高灵敏度和特异性也使其成为研究PRRSV传播和进化的重要工具。通过分析不同毒株的基因组特征，可以更好地理解病毒的变异规律，并为疫苗的开发提供参考。

综上所述，本研究通过系统分析和优化，开发出了一套能够有效检测、区分和量化PRRSV-1和PRRSV-2的方法。这些方法不仅提高了检测的准确性，还增强了病毒载量的量化能力。通过建立全面的样本库，我们能够进一步优化检测条件，并为实际应用提供可靠的依据。这些成果对于中国乃至全球的PRRS防控具有重要意义，有助于提高检测效率，减少经济损失，并为科学研究提供新的方向。