针对欧洲蜱传脑炎病毒英国亚型的新型定量特异性RT-qPCR检测方法

《Virus Research》：Novel quantitative and specific RT-qPCR assay for UK subtypes of European strain of Tick-borne encephalitis virus

tick-borne encephalitis virus (TBEV)和louping ill virus (LIV)的交叉反应难题，开发了一种基于锁定核酸探针的新型RT-qPCR检测方法。该方法通过设计靶向TBEV与LIV在NS1基因区域的特异性探针，在保持高灵敏度的同时有效排除LIV干扰。实验验证显示该方法对欧洲型TBEV的检测灵敏度为13 copies/reaction，特异性达94%，在43份临床样本中成功区分TBEV与LIV。该技术为英国等共循环地区提供了精准的分子诊断工具，支持疫苗策略和公共卫生决策。

　　在英国，两种与蜱相关的正黄病毒属病毒（Orthoflaviviruses）——蜱传脑炎病毒（TBEV）和狼疮热病毒（LIV）已被检测到。这两种病毒的基因序列和结构高度相似，导致在诊断过程中出现显著的交叉反应问题，这对临床准确诊断和病原体监测构成了挑战。为了应对这一问题，研究人员开发了一种新的实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测方法，该方法利用了英国最近发现的TBEV亚型，并结合了一种包含锁定核酸（LNA）的探针，以提高探针与目标RNA/DNA之间的杂交效率，从而增强对热力学相似序列的区分能力。

该检测方法的验证采用了细胞培养的病毒提取物以及非结构蛋白1（NS1）基因的体外转录产物。结果显示，TBEV的检测灵敏度达到了每反应13个拷贝，并且在95%置信度下具有94%的效率。同时，该检测方法对10种其他黄病毒的RNA提取物没有交叉反应，表明其高度的特异性。在对43份临床蜱咬样本的测试中，23份样本被证实为TBEV血清学阳性，而所有样本均未在当前使用的qPCR检测中呈阳性，这与新方法的结果一致。这种高灵敏度和高特异性的RT-qPCR方法能够有效区分英国本土的TBEV亚型与LIV，这对英国的公共卫生和动物健康监测具有重要意义，尤其是在这两种病毒共存且交叉反应仍是一个显著诊断难题的地区。

蜱传脑炎病毒（TBEV）是黄病毒科的一员，是许多重要人类病原体之一。TBEV主要通过蜱虫传播，特别是属于Ixodes属的蜱虫。TBEV感染通常呈现双相病程，初期症状包括发热、肌肉疼痛和乏力等类似流感的症状，随后可能发展为脑炎、脑膜炎或脑膜脑炎。尽管目前尚无抗病毒治疗方法，但欧洲和加拿大已有两种灭活疫苗获批使用，能够有效预防严重疾病。然而，疫苗接种率在一些国家如奥地利和拉脱维亚已达到80%。TBEV在欧洲和亚洲广泛流行，2022年欧洲及关联国家确诊了3650例病例。TBEV有三种主要亚型：远东型、西伯利亚型和欧洲型，其中欧洲型感染后神经系统受累的比例估计为13-44%。此外，还发现了两种新的亚型：贝加尔型和喜马拉雅型。

狼疮热病毒（LIV）与欧洲型TBEV的基因序列相似度高达85%，并且在英国，尤其是有放牧山羊的高地地区广泛存在。LIV感染主要与山羊和红腿雉有关，对山羊的致死率在5-60%之间，取决于年龄和母体抗体水平。尽管曾有一种甲醛灭活疫苗用于动物，但该疫苗近年来已停用。人类感染LIV的情况较为罕见，自1934年以来仅记录了44例，主要发生在动物饲养员、兽医和实验室工作人员中。LIV感染的临床表现多样，包括无症状感染、单相发热或双相感染伴随神经系统症状。虽然大多数病例出现在免疫功能正常的个体中，但免疫功能低下者可能面临更严重的病情，这一方面尚未进行充分研究。

目前在英国用于检测TBEV的RT-PCR方法由Schwaiger等人开发，该方法能够检测欧洲型TBEV，但也能够检测LIV，这在英国两种病毒共存的情况下造成了诊断上的混淆。由于TBEV和LIV之间的高交叉反应性，现有的商业ELISA和免疫荧光（IFA）检测方法无法提供高特异性的区分。因此，开发一种能够准确区分这两种病毒的分子检测方法对于临床诊断和病原体监测至关重要。

研究人员通过比较欧洲型TBEV和LIV的完整基因组序列，识别出NS1基因中一个具有高度序列差异的区域，该区域被选作引物和探针的设计目标。NS1蛋白是黄病毒中一个重要的非结构蛋白，其在病毒复制过程中发挥关键作用。通过在探针中引入LNA修饰，研究人员增强了探针与目标RNA之间的杂交稳定性，提高了检测的特异性。LNA的引入不仅提高了探针对目标序列的识别能力，还增强了其对非目标序列的排斥性，从而减少了交叉反应的可能性。

在检测方法的优化过程中，研究人员测试了不同浓度的引物和探针，以及不同的比例组合，以确定最有效的检测条件。最终确定的引物和探针浓度为200nM引物和100nM探针，以在保证灵敏度的同时减少非特异性扩增。通过体外转录（IVT）标准品的测试，该检测方法的灵敏度被确认为每反应13个拷贝，并且在不同实验重复中表现出良好的重复性和线性范围。此外，检测方法在不同浓度的TBEV RNA样本中均表现出一致的指数扩增，进一步验证了其可靠性。

在临床样本的测试中，研究人员对43份急性蜱咬样本进行了检测，结果显示所有样本在新检测方法中均为阴性，而其中23份样本在血清学检测中呈阳性。这表明该检测方法能够有效区分TBEV感染和非特异性反应，特别是在TBEV和LIV共存的环境中。同时，该方法对其他常见的黄病毒如登革热病毒（DENV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、西尼罗病毒（WNV）等均未产生交叉反应，进一步验证了其特异性。

该研究的局限性在于未能对远东型和西伯利亚型TBEV进行实际检测，因为这些亚型需要在生物安全四级实验室中处理，而目前研究人员无法获得这些病毒样本。此外，由于TBEV感染在英国较为罕见，且病毒血症期较短，导致难以获取PCR阳性的临床样本进行大规模验证。尽管如此，研究人员通过使用43份代表性的临床样本，成功验证了该检测方法的特异性。该方法的设计和应用为未来开发针对其他新兴黄病毒的诊断工具提供了模板，特别是在需要应对交叉反应问题的地区。

总的来说，该研究开发了一种能够有效区分英国本土TBEV亚型与LIV的RT-qPCR检测方法，提高了临床诊断的准确性和公共卫生监测的能力。随着TBEV在欧洲范围的扩散，这种检测方法对于及时识别病例、减少LIV感染的误诊以及制定针对性的干预措施具有重要意义。该方法的实施将有助于提高公众和医疗人员对TBEV流行情况的认知，为未来的公共卫生政策和疾病防控提供科学依据。