综述：剪接变异的全基因组功能注释与解释：迈向RNA靶向治疗

《Journal of Human Genetics》：Genome-wide functional annotation and interpretation of splicing variants: toward RNA-targeted therapies

这篇综述系统阐述了剪接破坏性变异（splice-disruptive variants）的注释、预测及临床解读策略，强调了其在遗传病诊断和RNA靶向治疗（如反义寡核苷酸SSOs、小分子调节剂）开发中的关键作用。文章详细介绍了从传统表型优先到基因组优先（genome-first）范式的转变，并深度评述了基于深度学习（如SpliceAI）和 motif 分析（如MaxEntScan）的计算预测工具，为精准医学提供了新的诊断与治疗路径。

　　

剪接变异的功能注释与临床解读：从机制到治疗

RNA剪接是真核生物基因表达的关键步骤，它通过精确去除前体mRNA（pre-mRNA）中的内含子并将外显子连接，产生成熟的转录本。这一过程由剪接体（spliceosome）——一个由五种小核核糖核蛋白（snRNPs，包括U1、U2、U4、U5和U6）及大量相关蛋白组成的大分子复合物——所催化。剪接位点（SSs）的识别依赖于保守的顺式作用元件：5‘剪接位点（供体位点）、分支点序列（BPS）、多嘧啶区（PPT）和3’剪接位点（受体位点）。这些元件与多种RNA结合蛋白（RBPs）结合并受其调控。

剪接异常的分子机制与类型

剪接破坏性变异可通过多种机制干扰正常的RNA加工。经典剪接位点（如破坏GU/AG二核苷酸）的突变长期以来被认为会导致遗传病。然而，目前越来越清楚的是，同义变异、深度内含子变异和调控区变异同样可以扰乱剪接事件。主要的异常剪接类型包括：

1. 1.
   替代剪接位点使用：变异削弱经典剪接位点或产生新的隐蔽剪接位点（cryptic sites），导致外显子延长或缩短。
2. 2.
   外显子跳跃（Exon skipping）：当剪接体无法识别外显子两侧的剪接位点时发生，常导致开放阅读框（ORF）破坏和无义介导的mRNA降解（NMD）。
3. 3.
   伪外显子激活（Pseudoexon activation）：变异导致本不应被包含的内含子序列被异常纳入成熟转录本。
4. 4.
   内含子滞留（Intron retention）：内含子未被正确切除，可能引入提前终止密码子（PTC）。
5. 5.
   内含子产生（Intron creation）：外显子变异产生新的剪接位点，将现有外显子分割。

重要的是，剪接异常通常是环境依赖性的，很少是简单的“非此即彼”过程。不完全的剪接位点识别常产生正常和异常转录本的混合物，其相对丰度受组织特异性表达的转作用剪接调节因子（如SRSF蛋白、hnRNP）调控。

计算预测工具的演进与应用

随着基因组诊断从表型优先转向基因组优先（特别是全基因组测序WGS）范式，亟需系统策略来识别和解读剪接破坏性变异。计算预测工具的发展经历了从基于 motif 的评分（如MaxEntScan、ESEFinder），到机器学习模型（如SVM-BPfinder），再到深度学习模型（如SpliceAI、MMSplice、Pangolin）的演进。深度学习模型能够整合数千碱基对的序列上下文，直接以单核苷酸变异（SNVs）为输入，高精度预测隐蔽剪接位点使用、伪外显子激活和外显子跳跃等事件。

为了进一步提高预测性能和临床适用性，集成多个层面（如 motif 评分、深度学习预测、进化保守性）的复合致病性评分工具被开发出来，例如PDIVAS、BPHunter和SQUIRLS。这些工具在基因组规模的诊断工作流中发挥着关键作用。然而，深度学习模型常被视为“黑箱”，缺乏生物学透明度。因此，实践中常采用组合策略：利用深度学习模型（如SpliceAI、PDIVAS）进行变异初筛，再借助基于 motif 的工具（如MaxEntScan、SVM-BPfinder）进行下游机制解读，以提高敏感性和可解释性。

功能验证与致病性评估

计算预测的候选变异需通过实验验证以确认其剪接效应和致病性。主要方法包括：

• •
  患者来源RNA的RT-PCR或RNA-seq分析：这是检测疾病相关组织（如肌肉）中异常转录本最直接的方法。若组织不可及，可诱导多能干细胞（iPSCs）分化为靶细胞进行模拟。
• •
  小基因剪接实验（Minigene splicing assays）：将包含候选变异及侧翼序列的基因组区域克隆至载体，转染细胞后分析剪接结果，适用于患者RNA不可得的情况。

实验验证不仅确认预测，还可能揭示意料之外的剪接机制。其结果可为ACMG/AMP指南下的变异分类提供关键证据（如PS3、PVS1）。

挑战与未来展望

当前剪接预测仍面临敏感性与可解释性之间的权衡、组织特异性预测的挑战（大多数模型未整合疾病相关组织或细胞类型的转录组背景），以及ACMG/AMP指南对非经典剪接变异解读的局限性。未来方向包括整合组织特异性剪接数据集（如GTEx）、开发结合序列基础和表达特征的可解释模型，以及利用单核RNA测序（snRNA-seq）和空间转录组学等新技术在特定细胞和组织背景下直接评估剪接调控。

迈向RNA靶向治疗

对剪接异常致病作用的深入认识推动了RNA靶向疗法的发展。剪接破坏性变异，特别是同义变异和非编码区变异，通常保持编码序列完整，使其成为RNA靶向治疗的理想候选者。主要策略包括：

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  剪接转换反义寡核苷酸（SSOs）：如用于脊髓性肌萎缩症（SMA）的nusinersen（促进外显子包含）和用于杜氏肌营养不良症（DMD）的eteplirsen等（介导外显子跳跃），通过结合pre-mRNA特定序列调控剪接。
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  小分子剪接调节剂：如用于SMA的risdiplam，具有全身分布和非侵入性给药的优点。
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  RNA编辑和基因治疗：如用于RNA编辑的CRISPR-Cas系统（如REPAIR、LEAPER）和腺相关病毒（AAV）载体基因治疗。

对于由私有或超罕见剪接破坏性变异引起的疾病，个性化或“N-of-1”医学正在兴起。核酸疗法（尤其是SSOs）的模块化和可快速编程特性，使得针对特定剪接破坏性变异的个体化治疗成为可能。

结论

剪接破坏性变异是遗传疾病的重要贡献者。计算预测算法的进步、 motif 水平机制分析和靶向实验验证相结合，为从全基因组测序数据中系统识别这些变异提供了更全面、生物学基础更坚实的框架。将剪接感知注释纳入临床诊断流程，可增强变异优先排序，支持意义未明变异（VUS）的重新分类。同时，日益丰富的RNA靶向疗法库凸显了精确解读剪接破坏性变异对于诊断和治疗的双重重要性。随着我们预测、验证和治疗性纠正剪接异常能力的持续扩展，将基于剪接的见解整合进基因组医学，有望为常见和超罕见疾病患者带来新的可能性。