利用单细胞和空间转录组测序技术解析胶质母细胞瘤中与预后相关的S100A9高表达单核细胞

《OncoTargets and Therapy》：Decoding the Prognosis-Related S100A9high Monocyte in Glioblastoma Using Single-Cell and Spatial Transcriptome Sequencing

胶质母细胞瘤中单核细胞异质性及免疫抑制功能研究，通过scRNA-seq和空间转录组测序结合功能分析，揭示S100A9高表达单细胞（S100hi_Mono）通过分泌IL-10、ROS和iNOS抑制T细胞功能，并与M2巨噬细胞、耗竭CD8+ T细胞及内皮细胞空间邻近，形成免疫抑制微环境，且该亚群比例升高与患者预后不良显著相关。

　　在人类脑肿瘤中，单核细胞和巨噬细胞被认为是主要的免疫细胞群体，它们在肿瘤进展过程中扮演着关键角色。尽管这些细胞的重要性已被广泛认可，但它们的异质性——特别是单核细胞内部的多样性——仍缺乏深入的了解。本研究通过整合多种前沿技术，如单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组测序以及免疫荧光和T细胞共培养实验，系统性地揭示了单核细胞和巨噬细胞在胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）中的异质性及其功能特征。研究发现，一种名为S100A9高表达的单核细胞亚群与较差的患者预后密切相关，并且这些细胞可能通过促进血管生成和诱导M2型巨噬细胞极化，从而形成有利于肿瘤生长的免疫抑制性微环境。

胶质母细胞瘤是脑肿瘤中最常见、最恶性的一种类型，即使采用积极治疗手段，患者的中位生存期仍然仅有约15个月。肿瘤微环境（TME）的抑制性是导致肿瘤恶性进展和治疗抵抗的重要因素之一，而这种抑制性微环境主要由免疫抑制性细胞如肿瘤相关髓系细胞和调节性T细胞等组成。这些细胞不仅促进T细胞的凋亡和耗竭，还通过多种机制诱导免疫抑制性微环境，从而加速肿瘤的生长和扩散。然而，由于技术限制，目前对胶质母细胞瘤免疫微环境的理解仍然有限。因此，解析胶质母细胞瘤中复杂的免疫微环境和肿瘤间异质性对于揭示肿瘤发生和进展的机制，以及发现新的免疫治疗靶点和开发更有效的治疗策略具有重要意义。

近年来，单细胞多组学技术的出现和发展，为解析在稳态和疾病状态下免疫细胞的异质性提供了前所未有的分子分辨率。这些技术帮助研究人员识别了新的胶质母细胞瘤标志物，并为临床治疗策略和药物靶点的开发提供了理论依据。更重要的是，通过单细胞转录组测序和生物信息学分析，可以更精确地解析肿瘤微环境中免疫细胞的异质性，并进一步明确其关键分子信号通路和基因调控网络，为更系统和精准地理解胶质母细胞瘤患者的异质性奠定了基础。此外，单细胞转录组测序还为解析肿瘤微环境中细胞间通讯和分子网络提供了新视角，有助于深入理解胶质母细胞瘤的病理生理学演变，并为下一代多模式治疗方案的开发提供参考。

在本研究中，我们通过基于配体-受体网络的分析，识别并表征了三种不同的胶质母细胞瘤亚型。其中，C3亚型表现出最差的预后，而C1和C2亚型的预后相对较好。为了进一步探讨这三种亚型的转录组特征，我们进行了基因本体（GO）富集分析，发现C3亚型主要富集了与免疫抑制、血管生成以及肿瘤侵袭相关的信号通路。具体而言，C3亚型中高表达的基因包括与免疫抑制相关的IL10、HAVCR2、ARG1和IDO1，以及与血管生成相关的VEGFA、ANGPT1、ANGPT2、NRP1、EFNB2和EPHB4。这些结果表明，C3亚型的肿瘤具有较强的免疫抑制性，并且其微环境可能更容易支持肿瘤的生长和转移。

为了进一步解析免疫微环境的异质性，我们使用了基于转录组数据的免疫细胞浸润推断方法，对三种亚型的免疫细胞组成进行了分析。结果显示，C3亚型中CD8+ T细胞、静息自然杀伤（NK）细胞的比例较高，而CD4+记忆T细胞和活化的NK细胞比例较低。此外，C3亚型中M2型巨噬细胞的比例显著高于C1和C2亚型，这进一步证实了C3亚型的免疫抑制性。这些发现表明，C3亚型的肿瘤微环境可能更倾向于抑制免疫反应，从而影响患者的预后。

我们还对单核细胞和巨噬细胞的异质性进行了深入分析。通过单细胞转录组测序，我们识别了九个单核细胞和巨噬细胞的亚群，其中S100A9高表达的单核细胞亚群（S100hi_Mono）表现出显著的免疫抑制性特征。这些细胞不仅高表达与免疫抑制相关的基因，如OLR1和IL1B，还显示出较高的MDSC评分和抗炎评分。此外，S100hi_Mono亚群还表现出较高的血管生成评分，这表明它们可能在促进肿瘤血管生成方面发挥重要作用。我们进一步通过空间转录组测序和免疫荧光分析，发现S100hi_Mono细胞在空间上与M2型巨噬细胞、内皮细胞和耗竭的CD8+ T细胞紧密相邻，这种空间分布模式可能有助于形成免疫抑制性微环境。

为了验证S100hi_Mono细胞的免疫抑制功能，我们进行了T细胞共培养实验。结果显示，S100hi_Mono细胞显著抑制了T细胞的增殖，并且其分泌的免疫抑制性细胞因子IL-10水平显著高于对照组。此外，S100hi_Mono细胞还表现出较高的活性氧（ROS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平，这些分子可能通过多种机制影响T细胞的功能。这些实验结果进一步支持了S100hi_Mono细胞在胶质母细胞瘤中的免疫抑制作用。

本研究还发现，S100hi_Mono细胞可能通过多种途径促进肿瘤进展。除了通过分泌免疫抑制性细胞因子构建免疫抑制性微环境外，它们还可能通过促进肿瘤相关内皮细胞的生成，间接支持肿瘤的血管生成和生长。因此，针对S100hi_Mono细胞的干预可能具有双重效果，不仅能够抑制肿瘤的生长，还可能逆转其免疫抑制性微环境，从而提高治疗效果。然而，S100hi_Mono细胞的起源及其转化为免疫抑制性细胞的机制仍有待进一步研究。随着单细胞基因组学技术的不断发展，结合谱系追踪技术，未来有望更深入地解析这些关键细胞群体的来源和演变过程，为早期肿瘤干预提供新的思路。

此外，本研究中发现的S100hi_Mono细胞可能成为新的免疫治疗靶点。由于其在胶质母细胞瘤中的关键作用，针对这一亚群的治疗策略可能为改善患者预后提供新的方向。例如，使用抗血管生成药物如贝伐珠单抗（Bevacizumab）可能有助于抑制S100hi_Mono细胞诱导的血管生成，从而减少肿瘤的营养供应和生长能力。同时，针对S100hi_Mono细胞的免疫检查点抑制剂或细胞因子阻断剂可能有助于恢复T细胞的活性，提高免疫系统的抗肿瘤能力。这些策略的开发和验证需要进一步的临床前研究和临床试验，以评估其安全性和有效性。

本研究的结果不仅加深了我们对胶质母细胞瘤免疫微环境异质性的理解，也为未来的免疫治疗策略提供了新的思路。通过精准识别和靶向S100hi_Mono细胞，可能能够有效打破肿瘤的免疫逃逸机制，提高治疗效果。此外，研究还揭示了肿瘤与微环境之间的复杂互动关系，强调了免疫细胞在肿瘤进展中的重要性。未来的研究应进一步探索这些免疫细胞的起源、功能机制以及可能的治疗靶点，以期为胶质母细胞瘤的精准治疗提供更全面的理论支持和实践指导。