《Analytica Chimica Acta》：A protocol integrating aptamer based magnetic separation and gentle
dsDNAse cleavage for exosomes isolation and multi-exosomics analysis
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外泌体作为细胞间通讯的关键介质，其低分子量生物分子在疾病发生中起重要作用。本研究提出多组学整合的快速外泌体分离方法（multi-exosomics），采用CD63靶向的aptamer磁珠捕获外泌体，并通过dsDNAse酶解特异性DNA连接臂实现高效纯化。该方法在70分钟内完成外泌体分离，回收率达82.52%-95.13%，检测限低至1.3×10^4颗粒/μL。通过甲醇超声裂解同步提取代谢物和蛋白质，经UPLC-MS分析验证其与超速离心法结果高度一致。临床样本验证显示该方法具有良好可行性和应用潜力，解决了传统方法耗时、耗材多、纯度低的问题，为外泌体多组学研究提供了高效解决方案。
孙菲菲|姜晓菲|史家琛|张宇|刘向阳|刘远发|谭钦平|陈明权|徐永江
中国江南大学食品科学与技术学院食品科学与资源国家重点实验室，江苏省食品安全与质量控制协同创新中心，无锡
摘要 背景 外泌体作为细胞间通讯的关键介质，在多种疾病的发病机制中扮演着越来越重要的角色。多组学研究揭示了外泌体中低分子量生物分子的功能作用。然而，从生物基质中分离外泌体的传统方法耗时且繁琐，限制了多组学分析的样本准备。
结果 我们提出了一种名为“多外泌组学”的创新方法，该方法结合了快速分离技术和多组学分析，能够同时检测外泌体中的代谢物和蛋白质。在分离过程中，使用针对CD63蛋白的适配体功能化磁珠（MBs）捕获外泌体，并利用dsDNAse 酶纯化外泌体。该方案表现出高灵敏度、特异性和抗干扰能力，检测限为1.3×104 个颗粒/μL，回收率在82.52%至95.13%之间。整个分离过程仅需70分钟。分离后，将外泌体溶解于甲醇中，经超声处理后离心，上清液用于提取代谢物，沉淀物则用变性剂溶解以提取蛋白质。这种同步处理方式减少了样本消耗和潜在偏差。通过该方法鉴定出的蛋白质和代谢物与超离心法获得的结果高度一致。
意义 总之，“多外泌组学”为外泌体分离和多组学分析提供了一个快速有效的平台。其在临床样本中的应用证明了其可行性，并有望推动外泌体生物学研究的进展。
引言 外泌体是一种直径为30-150纳米的膜状囊泡，由多种细胞分泌[1],[2]。它们广泛存在于尿液、血清和眼泪等多种生物液体中[3],[4]。大量证据表明，外泌体在细胞间通讯、免疫调节和感染过程中发挥着关键作用[5],[6],[7]。重要的是，外泌体携带的低分子量生物分子可以调节细胞代谢途径，从而导致功能障碍和疾病发生。因此，全面分析外泌体中的代谢物和蛋白质对于阐明其在疾病研究中的潜力至关重要。
近年来，多组学技术极大地推进了我们对外泌体生物学和功能的理解[8],[9],[10]。然而，传统的单组学分析策略面临诸多挑战，包括对样本量的高要求以及难以解析复杂的内部关联[11],[12],[13]。新开发的多组学方法能够从单个样本中同时提取代谢物和蛋白质，并通过超高性能液相色谱-质谱（UPLC-MS）进行整合分析，这一综合方法在外泌体多组学研究中取得了显著进展[14]。
有效的样本制备仍然是外泌体多组学分析的主要挑战。传统方法（如超离心、聚合物沉淀和免疫吸附分离）存在操作复杂、分析设备昂贵、重复性差以及生物分子覆盖范围有限等问题[15],[16],[17],[18]。目前，新的外泌体分离策略正在逐渐出现。例如，周等人开发的磷脂酰丝氨酸印迹材料[19]以及陈等人开发的针对磷酸基团表位的分子印迹聚合物[20]在分离和识别外泌体方面表现出高效性和特异性。此外，范等人[18]构建了一种三螺旋分子探针用于快速捕获外泌体，双适配体修饰的Fe3 O4 @SiO2 纳米颗粒也被用于外泌体富集，尽管这些方法提高了富集效率和操作简便性[6],[21],[22]，但严苛的洗脱条件（如低pH值缓冲液或洗涤剂）[15]可能影响后续的外泌体分析[23]。
为了解决这些问题，我们开发了一种利用dsDNAse 酶快速分离外泌体的方法。dsDNAse 是一种双链DNA特异性核酸酶，能高效切割磷酸二酯键。该酶在20至40℃范围内保持高活性，加热至55℃5分钟后可完全失活。该方法结合了基于适配体的磁分离技术和dsDNAse 的温和酶切作用，实现了高效的外泌体纯化。结合多组学分析，我们开发了一种名为“多外泌组学”的新方法。该方法在临床研究中的表现证明了其实用性。
材料与设备 有关材料和设备的详细信息，请参见
支持信息文本S1 和
文本S2 。所有样本收集和实验均获得了江南大学实验伦理审查委员会的批准（JNU202403RB091）。
快速分离协议的制备 该分离协议依赖于构建的荧光生物传感器。具体步骤如下：
首先，根据特定原理合成Aptamer 1@ Strand 2@ Strand 3（A1@S2@S3）
多外泌组学分析流程 根据流程图（图1），利用构建的荧光生物传感器通过CD63与A1之间的特异性结合相互作用捕获外泌体。S2-5'-6FAM从淬灭基团BHQ1上解离，这种空间分离使得绿色荧光可被检测到[28]。随后使用dsDNAse 酶切割A1和S3之间的磷酸二酯键，将外泌体从生物传感器上释放出来。之后提取蛋白质和代谢物
结论 总之，“多外泌组学”结合了快速分离技术和多组学分析，为外泌体研究提供了全面的框架。与传统方法相比，该方法具有以下优势：1）整个外泌体分离过程可在70分钟内完成，大大缩短了处理时间；2）该方法提高了外泌体的纯度，同时实现了微量样本分析；3）能够同时提取蛋白质和代谢物
CRediT作者贡献声明 徐永江： 撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金筹集。孙菲菲： 撰写 – 初稿撰写、数据可视化、方法设计、实验实施、数据管理。姜晓菲： 概念构思。陈明权： 资源提供、数据分析。谭钦平： 监督、概念构思。史家琛： 方法设计、实验实施、数据管理。张宇： 方法设计、概念构思。刘向阳： 数据管理。刘远发： 监督、概念构思
利益冲突声明 作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢 中国自然科学基金（32172136）；中国食品科学技术研究院-伊犁健康科学基金会（2023-Y12）；江南大学食品科学与资源国家重点实验室研究项目（编号SKLF-ZZB-202409）。
