《Aquaculture》：Evaluation of synthetic peptide vaccines based on phage display technology for grass carp reovirus
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草鱼越小病毒（GCRV-II）疫苗开发中，通过四次生物淘洗从Ph.D.-12噬菌体展示肽库筛选出P1、P2高亲和力肽，合成肽疫苗免疫草鱼后显著提升血清抗体及免疫基因表达，20μg/g剂量组效果最佳，攻毒实验显示P1（46.05%）和P2（53.95%）组存活率高于对照组，证实其作为GCRV-II疫苗抗原的潜力。
邓珠阳|李玉雅|刘永奇|陈乐阳|赵钊|朱斌
中国海南省三亚市西北农林科技大学海南研究院，572024
摘要
草鱼呼肠孤病毒（GCRV）是一种具有高度传染性和致病性的鱼类病毒，对草鱼养殖业造成了严重危害。开发合适的疫苗被认为是预防GCRV感染的有效策略。在本研究中，我们对Ph.D.-12噬菌体展示文库进行了四轮生物淘选。我们发现了能够与GCRV-II感染草鱼血清中的特异性抗体结合的目标序列，并从中筛选出了两种高亲和力肽P1和P2。这两种肽与弗罗因德完全佐剂（Freund's complete adjuvant）混合后制备成了合成肽疫苗，用于免疫草鱼以验证其效果。实验结果显示，经过四轮生物淘选后，噬菌体的富集倍数高达468倍，且这些肽对GCRV-II感染草鱼的血清表现出强烈的结合亲和力。与对照组相比，接种合成肽疫苗组的血清特异性抗体水平、非特异性免疫反应以及免疫相关基因的表达均显著上调。值得注意的是，20 μg/g剂量的合成肽疫苗组的免疫参数明显优于5 μg/g剂量的组。接种合成肽疫苗的草鱼在病毒挑战实验中的相对存活率分别为：P1佐剂组为46.05%，P2佐剂组为53.95%。这些结果表明，P1和P2具有作为有效抗原候选物的潜力，并对GCRV-II感染具有预防和治疗作用。
引言
草鱼呼肠孤病毒（GCRV）是一种水生病原体，会导致草鱼出血病（GCHD），给养殖业带来巨大经济损失。GCHD主要发生在草鱼幼鱼和鱼苗阶段，表现为严重的出血症状和高死亡率（Chen等人，2021b, 2021c, 2021a）。通过对GCRV基因序列的分析，发现中国境内的GCRV菌株可分为三种类型（I、II、III）（Pei等人，2014）。目前，GCRV II型（GCRV-II）是中国最普遍的菌株，也是引发GCHD的主要病原体（Wang等人，2016）。
疫苗接种是目前预防鱼类病毒性疾病最有效的方法（Qiu等人，2021a, 2021b; Souto等人，2023）。中国最早在20世纪60年代批准了基于组织血浆的灭活GCHD疫苗。后续的减毒疫苗也显示出良好的保护效果（Rao和Su，2015；Zeng等人，2016）。近年来，亚单位疫苗因安全性与稳定性成为研究热点（Guo等人，2020）。研究表明，合成多肽可作为亚单位疫苗使用，并能刺激更高水平的抗体产生（Coeurdacier等人，2003）。Gong等人（2023）从针对罗非鱼湖病毒的肽库中筛选出一种疫苗，免疫后保护率为57.6%。这些研究表明，利用噬菌体展示技术筛选肽是一种可行的方法。
噬菌体展示技术首次发表于1985年（Smith，1985）。该技术可将外源DNA片段插入噬菌体，并在其表面展示重组肽或重组蛋白。通过与配体的相互作用，可以筛选出特定的目标肽和蛋白。噬菌体展示技术为先进疫苗的开发提供了新的方向。通过温和的生物淘选方法，可以从随机肽库（RPLs）中分离出高抗原性和免疫原性的模拟肽，为表位疫苗的开发提供了有效途径（Aghebati-Maleki等人，2016）。研究人员利用COVID-19患者的血清从噬菌体展示肽库中筛选出了SARS-CoV-2病毒蛋白上的两个潜在B细胞表位，为后续疫苗开发提供了帮助（Guo等人，2021）。目前也有研究使用商业化的随机噬菌体展示肽库来筛选和鉴定牛腹泻病毒的B细胞表位（Chen等人，2021b, 2021c, 2021a）。在鱼类疫苗领域，Xia等人（2024）通过筛选Ph.D.-12噬菌体肽库，发现了针对大口黑鲈虹彩病毒的两个特异性抗体靶点，并将其合成肽制备成表位疫苗，保护率为55.18%。
本文基于接种了GCRV-II的草鱼血清，从Ph.D.-12噬菌体肽库中筛选出两种GCRV-II模拟肽。将这些肽制备成合成肽疫苗后应用于草鱼，检测了免疫草鱼血清中的抗体水平、非特异性免疫反应以及组织中免疫相关基因的表达情况。随后进行了病毒挑战实验以评估疫苗的免疫保护效果。本研究提供了一种基于表位肽的GCHD疫苗设计策略，为GCRV-II疫苗的开发提供了参考。
实验部分
鱼类与病毒
实验所用草鱼健康，体长4.5±0.5厘米，体重0.8±0.2克，购自广东的一家大型鱼苗场。实验前，这些草鱼在循环水养殖系统中（温度28°C，pH 7.5–8.0）适应环境14天，并每天喂食两次。在后续实验前，通过RT-PCR检测确认它们未感染GCRV-II。所用引物如下：5′-CATACGATCGCTCCCAACTCC-3′（GCRV-F）
感染GCRV-II的草鱼血清滴度
我们在草鱼感染GCRV-II后的第7、14、21和28天检测了其血清抗体滴度（图1）。血清中的抗体滴度逐渐升高，在第21天达到峰值，是阴性血清的5.89倍。
噬菌体淘选富集倍数
我们对Ph.D.-12噬菌体肽库进行了四轮生物淘选，具体过程如图2A所示。每轮淘选后均测定了特定噬菌体的洗脱滴度和扩增滴度
讨论
GCHD是目前影响鱼类的最严重疾病之一，导致高死亡率和重大经济损失（Ma等人，2014）。使用鱼类疫苗对草鱼进行免疫是一种经济且安全的控制方法（Wang等人，2020a, 2020b）。研究表明，线性短肽可作为有效的抗病毒疫苗（Steward和Howard，1987）。研究人员开发了一种新的肽疫苗ECM-64，能够诱导强烈的免疫反应
结论
实验结果表明，利用噬菌体展示技术成功筛选出了两种针对GCRV-II的表位肽。基于这些肽制备的合成肽疫苗对草鱼具有一定的保护作用。
作者贡献声明
邓珠阳：撰写初稿、数据可视化、实验设计。李玉雅：方法学研究、数据管理。刘永奇：数据管理。陈乐阳：数据管理。赵钊：项目监督、资金获取、概念构思。朱斌：项目监督、资金获取、概念构思。
伦理声明
本研究中所有动物使用均获得了中国西北农林科技大学动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。实验过程符合动物福利和伦理规范。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划“海洋农业与淡水渔业技术创新”青年科学家专项项目（2023YFD2402400）的支持。
