A-234抑制剂对体外重组人类乙酰胆碱酯酶再激活能力的筛选

《Chemico-Biological Interactions》：Reactivation screening of A-234-inhibited human recombinant acetylcholinesterase in vitro

本研究系统评估了22种氧肟类活化剂对A-234抑制的HssAChE的体外复活效果，发现HL?-7和MMB-4在24小时后展现出高效活性恢复，动力学分析表明HL?-7具有更优的二阶反应速率常数。研究证实A-234对传统活化剂存在显著抗性，强调延长治疗窗口期的重要性。

　　在化学毒理学和军事医学领域，针对神经毒剂中毒的治疗研究一直是重要课题。A-234作为一种被归类为A系列神经毒剂（也称为“Novichoks”）的化合物，因其对人类重组乙酰胆碱酯酶（HssAChE）的强大且不可逆抑制作用，成为研究中的重点对象。该研究旨在评估22种结构多样的肟类复活剂对A-234抑制的HssAChE的复活效果，并与GB和VX毒剂的抑制情况进行比较，以探讨不同神经毒剂对复活剂的反应特性。

A系列神经毒剂，特别是A-234，是苏联在1970年代至1990年代期间开发和制造的一类新型化学武器。这些毒剂相较于以往的神经毒剂，具有更复杂的分子结构，其中央的磷酸基团上包含了一个取代的脒基结构，而不是常见的烷氧基结构。这种结构的改变使得A系列毒剂表现出更强的神经毒性和更高的致命性，同时也增加了治疗上的难度。A-234曾被用于2018年英国对前间谍 Sergei Skripal 及其女儿的尝试性暗杀事件，这一事件引起了全球对神经毒剂及其治疗手段的关注。

神经毒剂的作用机制主要依赖于其对乙酰胆碱酯酶的抑制。乙酰胆碱酯酶是一种在神经系统中发挥关键作用的酶，负责分解神经递质乙酰胆碱，以维持神经信号的正常传递。当神经毒剂与乙酰胆碱酯酶结合后，会阻断其催化功能，导致神经信号过度积累，引发一系列中毒症状，包括肌肉麻痹、呼吸衰竭、意识丧失等。因此，针对神经毒剂中毒的治疗必须迅速且有效，以尽可能恢复酶的活性，减少毒性对机体的损害。

目前，治疗神经毒剂中毒的三大支柱包括：对症抗胆碱药物、神经保护药物和因果性乙酰胆碱酯酶复活剂。抗胆碱药物主要用于缓解中毒症状，通过阻断乙酰胆碱在中枢和外周神经系统中的作用，以减少过度刺激。神经保护药物如苯二氮?类药物，可以用于预防或控制癫痫发作等并发症。而复活剂则通过与神经毒剂结合，解除其对乙酰胆碱酯酶的抑制，从而恢复酶的活性，帮助恢复正常的神经功能。

复活剂的作用机制涉及与神经毒剂形成复合物，并通过化学反应使其脱离乙酰胆碱酯酶。这种过程通常需要一定的时间，且不同复活剂对不同神经毒剂的复活效果存在显著差异。目前，市场上常见的复活剂主要包括2-吡啶基乙醇肟（2-PAM）、甲氧肟（MMB-4）、三甲氧肟（TMB-4）、LüH-6和HI-6等。然而，这些复活剂在面对A-234这类新型神经毒剂时，表现出一定的局限性。在一项先前的研究中，发现这些五种市售复活剂在单次给药的情况下，无法有效复活A-234抑制的HssAChE和丁酰胆碱酯酶（HssBChE）的活性，无论是体外还是体内实验均未取得显著成效。

本研究通过筛选22种结构不同的肟类复活剂，进一步探索其对A-234抑制的HssAChE的复活能力。这些复活剂包括五种市售产品，以及一些新型化合物，如HL?-7（一种具有两个肟基团的双吡啶??肟）和K239（唯一的一种四肟类化合物）。此外，研究还涵盖了对其他神经毒剂如塔崩（GA）和沙林（GB）具有较高复活效果的复活剂，如K027、K048、K074、K075、K1374、K1375、GM415、RS194B等。这些复活剂的选取基于其对特定神经毒剂的复活能力，如塔崩与A-234具有相似的磷酰胺结构，因此在选择复活剂时也参考了对塔崩的复活效果。

在实验过程中，首先对A-234、GB和VX三种神经毒剂抑制的HssAChE进行了10分钟的复活实验，以模拟早期战场环境下的治疗场景。结果显示，大多数复活剂在10分钟内对GB和VX的复活效果较为显著，但对A-234的复活效果则明显不足。随后，研究进一步延长了复活时间至24小时，以评估复活剂在长时间作用下的复活能力。经过24小时的复活实验，仅少数复活剂表现出高效的复活效果，包括HL?-7、MMB-4、K027、K048、K074、K075、GM415、K868、K869、K1375和RS194B等。其中，HL?-7和MMB-4被确认为最具复活潜力的复活剂。

复活剂的复活效果不仅与作用时间有关，还与其复活动力学密切相关。在对两种最具复活效果的复活剂进行240分钟的复活动力学分析后，研究发现HL?-7表现出比MMB-4更高的二阶复活速率常数。这表明HL?-7与A-234的结合能力更强，且其催化效率更高。这一发现对于理解不同复活剂对A-234的反应机制具有重要意义，并为未来开发更有效的复活剂提供了理论依据。

此外，研究还评估了这些复活剂的稳定性。在24小时的稳定性测试中，发现HL?-7、MMB-4、K027、K048、K074、K075、GM415、RS194B和K1375等复活剂表现出较高的稳定性，其活性在24小时后仍保持在98.8%以上。这说明这些复活剂在长时间作用下仍具有良好的化学稳定性，能够持续发挥作用，为治疗提供支持。而其他复活剂如2-PAM、TMB-4等则表现出较低的稳定性，其活性在24小时后有所下降，这可能影响其在实际治疗中的效果。

在讨论部分，研究指出，A-234抑制的HssAChE在早期复活过程中表现出较强的抗性，这与GB和VX抑制的酶复活效果形成鲜明对比。尽管在24小时的复活实验中，部分复活剂能够恢复酶的活性，但其复活效果仍不足以在急性中毒阶段提供显著的临床改善。然而，研究也强调，延长复活时间有助于提高复活效果，尤其是在面对A-234这类新型神经毒剂时，长时间的复活可能成为改善临床预后的关键因素。

在实际治疗中，医生通常会根据中毒情况和复活剂的特性选择合适的治疗方案。对于A-234中毒，由于其对乙酰胆碱酯酶的不可逆抑制，传统的复活剂可能无法在短时间内有效恢复酶活性。因此，研究建议在急性中毒阶段应考虑延长复活剂的使用时间，并结合其他治疗手段，如抗胆碱药物和神经保护药物，以提高整体治疗效果。此外，研究还提到，某些复活剂虽然在体外实验中表现出较高的复活效果，但在体内实验中可能受到其他因素的影响，如药物代谢、组织分布和血脑屏障等，这需要进一步研究以明确其在临床中的应用价值。

研究还提到，对于A-234中毒的治疗，尽管部分复活剂在24小时后能够恢复酶活性，但其恢复程度仍不足以在急性中毒阶段提供显著的临床改善。这可能意味着，针对A-234中毒的治疗需要更长时间的复活过程，甚至可能需要联合其他治疗手段，以达到最佳的临床效果。此外，研究指出，某些复活剂虽然在体外实验中表现出较高的复活效果，但在体内实验中可能受到其他因素的影响，如药物代谢、组织分布和血脑屏障等，这需要进一步研究以明确其在临床中的应用价值。

研究的结论强调，A-234对HssAChE的抑制作用在早期复活阶段表现出较强的抗性，而GB和VX则相对容易被复活剂逆转。尽管如此，某些复活剂如HL?-7和MMB-4在延长复活时间后仍表现出较高的复活效率，这为未来的治疗策略提供了参考。研究还指出，虽然部分复活剂在24小时后能够恢复酶活性，但其恢复程度仍不足以在急性中毒阶段提供显著的临床改善。因此，针对A-234中毒的治疗可能需要更长时间的复活过程，甚至需要联合其他治疗手段，以达到最佳的临床效果。

在实验方法部分，研究详细描述了所使用的化学试剂和实验条件。A-234、GB和VX等神经毒剂在实验前通过气相色谱-质谱法进行了纯度检测，确保其在实验中的可靠性。复活剂的体外实验则在磷酸缓冲液（PBS）中进行，以模拟生理环境。此外，研究还提到，某些复活剂的结构设计使其在特定条件下表现出更高的复活效果，如K868和K869等氯代双吡啶??肟类复活剂，相较于其母体化合物，表现出更优异的复活能力。

在研究过程中，研究人员还探讨了不同复活剂对神经毒剂的结合能力及其复活动力学。例如，HL?-7作为一种具有两个肟基团的双吡啶??肟，表现出更高的结合亲和力和催化效率，这可能是其在复活A-234抑制的HssAChE时表现出更高复活效果的原因。此外，研究还提到，某些复活剂可能通过非特异性作用机制，对其他生理系统产生一定的保护效果，如对心脏功能和肾功能的稳定作用。

综上所述，本研究通过系统评估22种结构不同的肟类复活剂对A-234、GB和VX三种神经毒剂抑制的HssAChE的复活效果，揭示了不同复活剂在面对不同神经毒剂时的反应特性。研究发现，A-234对HssAChE的抑制作用在早期复活阶段表现出较强的抗性，而延长复活时间有助于提高复活效果。此外，研究还强调了复活剂的结构设计对其复活能力的重要性，并为未来的治疗策略提供了参考。这些发现对于改善神经毒剂中毒的临床预后具有重要意义，并为开发更有效的复活剂提供了理论依据。