利用甲苯-4-单加氧酶通过固定化生物转化方法合成靛红，并通过分子动力学研究其区域选择性

《Dyes and Pigments》：Biosynthesis of indirubin by stationary biotransformation of indole using toluene-4-monooxygenase and understanding of its regioselectivity by molecular dynamics

本研究通过T4MO酶的静态生物转化过程，高效合成吲哚并高三烯（indirubin），产率达90%。分子对接和动态模拟表明，吲哚C2位与T4MO二铁中心结合紧密，促进C2羟基化，结构动力学显示复合物稳定。优化静态培养条件可提升indirubin产率，为绿色生物合成提供新方法。

　　

Raviteja Pagolu|Yong Yuk|Kwon-Young Choi

韩国京畿道水原市安东大学先进生物融合研究所

摘要

本研究通过使用甲苯-4-单加氧酶（T4MO）的固定生物转化过程研究了吲哚 Rubin 的生物合成。与其他单加氧酶不同，当以吲哚为底物时，T4MO 产生的吲哚 Rubin 量相对于靛蓝更多。在固定生物转化过程中，吲哚 Rubin 的产率达到了约 90%，而搅拌条件下则较低。接下来，我们通过分子对接和分子动力学（MD）模拟研究了吲哚在 T4MO 活性位点区域的位置特异性。分子对接结果显示，吲哚的 C2 位置与双铁中心非常接近，从而促进了 C2 位的羟基化，进而提高了吲哚 Rubin 的产量。RMSD（均方根偏差）计算表明，在 400 纳秒的模拟过程中，T4MO-吲哚复合物的结构稳定性很高。本文提出了 T4MO 介导的吲哚 Rubin 生物合成的固定反应条件和方法。在无旋转搅拌的固定培养条件下，能够高效地生产吲哚 Rubin。

引言

吲哚 Rubin 是一种天然化合物，常见于Indigofera和Isatis植物中，同时也作为人体内的代谢产物[1]。从结构上看，吲哚 Rubin 与靛蓝相似，都含有两个吲哚环；然而，吲哚 Rubin 的特点是第一个吲哚环的 C2 位点与第二个吲哚环的 C3 位点之间存在不对称双键，这使其在结构上不同于靛蓝[2]。第一个吲哚环的 C3 位点含有酮官能团，而另一个吲哚环的 C2 位点含有酮官能团。靛蓝呈蓝色，而吲哚 Rubin 则呈现红紫色[2]。

靛蓝主要用作牛仔布的染料，而吲哚 Rubin 传统上被用作药用成分[3],[4]。临床研究表明，吲哚 Rubin 及其衍生物具有抗癌作用，可以抑制癌细胞的生长和转移，并通过抑制关键免疫信号通路发挥抗炎作用[5],[6],[7],[8],[9],[10]。此外，动物实验还表明吲哚 Rubin 衍生物具有神经保护作用[11]。

此前已有多种吲哚 Rubin 的化学合成方法[12],[13]。最常用的方法是异靛蓝（isatin）与吲哚酚（indoxyl）或乙酰吲哚酚（acetyl indoxyl）之间的醛醇缩合反应[14]。在此过程中，通过脱乙酰化吲哚酚乙酸盐生成的吲哚酚阴离子与异靛蓝反应生成吲哚 Rubin。另一种方法是异靛蓝在还原剂（如 KBH₄）存在下发生二聚化[12]。还有其他利用吲哚酚中间体的合成方法也被报道过。

然而，化学合成过程使用有毒催化剂，并产生多种对环境有害的副产物[13],[15],[16]。此外，大规模生产面临诸多挑战，如苛刻的反应条件（如高温高压），导致效率低下和产物产率低[17],[18]。因此，生物催化和生物转化方法成为吲哚 Rubin 生物合成的有前景的替代方案。最近的研究主要集中在开发环保的生物转化方法，以减少碳排放[19],[20],[21]。

在生物转化过程中，吲哚 Rubin 是靛蓝生物合成的副产物。靛蓝可以通过生物质或底物（如吲哚或色氨酸）的生物转化来合成，其中吲哚-3-氧化酶（indole-3-oxidase）是这一途径中的关键酶[20],[22],[23],[24],[25]。作为副产物的吲哚 Rubin 的生成需要相关氧化酶的吲哚-2-氧化活性。最近的研究发现，细胞色素 P450 单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase，CYP）、黄素单加氧酶（flavin monooxygenase，FMO）和甲苯-4-单加氧酶（toluene-4-monooxygenase，T4MO）能够在靛蓝生物合成过程中生成吲哚 Rubin[4],[21],[26]。将Isatis tinctoria中的细胞色素 P450 单加氧酶（CYP71B102）异源表达到E. coli中，可以生成靛蓝、吲哚 Rubin 及其前体[27]。有趣的是，CYP71B102 与异靛蓝降解酶异靛蓝羟化酶（isatin hydroxylase）共表达可促进靛蓝的形成，而添加异靛蓝和 2-氧吲哚（2-oxindole）则能促进吲哚 Rubin 的形成[27]。值得注意的是，我们团队发现 T4MO 在吲哚 Rubin 生物转化中的活性高于 FMO 和 CYP 酶[21]。

本研究展示了无搅拌条件下的固定生物转化反应条件。此外，我们还利用分子对接和分子动力学模拟研究了吲哚在活性位点的定位以及 T4MO-吲哚复合物的结构动态。这些改进的条件有助于提高吲哚 Rubin 的生物合成效率，我们预计这些条件也可应用于吲哚 Rubin 衍生物的生物合成。

部分内容片段

化学品

l-色氨酸、吲哚、连二亚硫酸钠、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、二甲基亚砜（DMSO）和 NaOH 从 Sigma-Aldrich Korea（韩国水原）购买。M9 最小培养基和 LB 培养基从 Difco（韩国首尔）购买。本研究中使用的所有化学试剂均为分析级或更高级别。

用于生产靛蓝的细菌菌株和培养条件

MaFMO 和 T4MO 的基因序列分别来自M. aminisulfidivorans和P. mendocina KR1[28],[29]。这两个基因均通过化学方法合成。

具有区域选择性氧化的靛蓝和吲哚 Rubin 的生物合成途径

吲哚 Rubin 的生物合成始于吲哚，吲哚首先发生位置特异性氧化生成 3-氧吲哚和 2-氧吲哚，随后发生不对称二聚化（图 1）。二聚化反应通过 C2 和 C3 位点附近的自由基自发进行。在吲哚 Rubin 的生物合成过程中，吲哚的位置特异性氧化是一个关键步骤；当 C3 位的氧化活性超过 C2 位时，

结论

总之，本研究展示了 T4MO 酶催化的反应，这些反应同时生成靛蓝和吲哚 Rubin，重点研究了吲哚在 C2 和 C3 位的区域选择性氧化。在之前的 T4MO 基生物转化研究中，我们发现用硫酸调节 pH 值显著提高了吲哚 Rubin 的产率。T4MO 反应是一个连续的氧化过程，利用氧气作为底物生成靛蓝和吲哚 Rubin。

CRediT 作者贡献声明

Kwon-Young Choi：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、监督、资金获取、概念构思。Raviteja Pagolu：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、实验研究。Yong Yuk：撰写 – 原稿、方法学设计、实验研究、数据整理

利益冲突

作者声明没有已知的利益冲突。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能的利益冲突/个人关系：Kwon-Young Choi 表示获得了韩国国家研究基金（National Research Foundation of Korea）的财政支持。Kwon-Young Choi 还表示获得了韩国工业技术评估院（Korea Evaluation Institute of Industrial Technology）的财政支持。如果还有其他作者，他们也声明没有已知的利益冲突或可能影响研究的个人关系。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会（National Research Foundation of Korea，NRF）的支持，该基金会由教育科学技术部（Ministry of Education, Science, and Technology，MEST）资助 [2021R1A2C1007519 和 RS-2025-02217886]，以及 MOTIE/KEIT 的研发计划 [资助编号：20014350, 20025698 和 RS-2025-09312968] 的支持。