综述：KLAK肽在抗癌治疗中的应用：通过引入归巢结构域及其他修饰方式破坏线粒体膜，诱导癌细胞凋亡

《European Journal of Medicinal Chemistry》：KLAK peptide in anticancer therapy: Achieving cancer cell apoptosis via mitochondrial membrane disruption using homing domains introduction and other modifications

KLAK肽通过破坏线粒体膜诱导细胞凋亡，但其体内分布不均和细胞摄取不足。综述讨论了融合细胞穿透肽、靶向肿瘤新生血管的序列及氨基酸修饰等策略以提高疗效。

　　KLAK是一种具有抗菌和抗癌活性的α-螺旋肽，其序列是KLAKLAKKLAKLAK。这种肽因其能够破坏细菌膜以及真核细胞的线粒体膜，而被广泛研究用于杀灭癌细胞。然而，KLAK自身存在一些问题，例如其在体内的分布不理想，细胞内化能力较低，导致其抗癌效果不足，同时可能对健康组织产生毒性。因此，研究者们尝试通过多种策略来克服这些限制，以提高其在体外和体内的抗癌效果。这些策略包括使用基于肽的归巢结构域或对氨基酸进行修饰。

癌症仍然是全球范围内最具威胁性的疾病之一，尽管传统的治疗方法如化疗、放疗和手术已经取得了显著进展，并且不断有新的方法被引入，但仍然存在许多未满足的医疗需求，例如胰腺癌和肉瘤等。近年来，基于肽的药物在多种疾病治疗中受到了越来越多的关注，包括癌症、糖尿病和细菌及病毒感染。抗癌肽（ACPs）是肽类抗癌药物的一种，通常由5至50个氨基酸残基组成。这些肽可以来源于天然，例如蝇毒素（cecropins）、蛙皮素（magainins）或蜂毒肽（melittin），也可以是合成的，如SVS-1、KLAK或D-K6L9等。ACPs的作用机制多种多样，其中大多数通过破坏细胞膜起作用，但也有部分具有免疫调节或抗血管生成的效果，有些还能通过诱导分化、抑制迁移和转移或逆转药物耐受性等机制发挥抗癌作用。

KLAK肽最初于1996年由Javadpour等人描述为一种新设计的抗菌肽。该研究中，作者制备了含有不同氨基酸（如丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸和赖氨酸）的7、14和21个残基长度的肽，并评估了其对多种细菌、人类红细胞和小鼠成纤维细胞的毒性。结果显示，KLAK在抗菌方面表现出显著活性，同时对真核细胞的直接毒性较低。同年，Dathe等人研究了一种类似的肽KLAL，以及在不同位置用D-氨基酸替代的肽，探讨了它们的螺旋性、膜相互作用、抗菌和溶血活性。这项研究的重要性在于发现，这种两亲性阳离子肽的膜相互作用主要由膜成分和肽的螺旋性决定，因为其主要机制是静电相互作用。

1999年，Ellerby等人使用D-klak来研究其对癌细胞的作用，发现D-klak能够破坏线粒体膜，这与其脂质组成相似于细菌膜有关。该研究通过细胞自由系统中的线粒体肿胀实验以及电子显微镜观察到形态变化，证明了D-klak对癌细胞的破坏能力。研究还表明，D-klak导致线粒体膜破裂，从而引发细胞凋亡，通过激活caspase 3实现。

为了提高KLAK/D-klak的细胞内化能力，研究者们尝试将其与细胞穿透肽（CPPs）融合。CPPs是一类能够促进多种载荷进入细胞的肽，被广泛用于ACPs和其他药物输送系统。例如，Mai等人将KLAK与PTD-5（蛋白转导结构域）肽融合，通过这种结构域促进了细胞的摄入，使得KLAK能够破坏线粒体并诱导细胞凋亡。与游离的KLAK相比，这种融合肽显著降低了小鼠成纤维肉瘤细胞和人类头颈肿瘤细胞的存活率，并在体内实验中显示出对肿瘤生长的抑制作用。

此外，研究者们还尝试使用靶向肿瘤新生血管的归巢结构域，如CNGRC（靶向CD13）和RGD（靶向αvβ3整合素）。这些结构域被广泛用于多种生物材料中，以提高药物在肿瘤部位的靶向性。例如，Ellerby等人首次报道了使用CNGRC和RGD结构域来靶向KLAK/D-klak的实验，显示出这两种结构域在提高抗癌效果方面的重要作用。CNGRC-D-klak融合肽在KS1767细胞系（一种来源于卡波西肉瘤的肿瘤细胞）中表现出比单独的D-klak更高的细胞毒性。RGD-D-klak融合肽在乳腺癌细胞系中同样表现出较高的毒性。

除了上述的归巢结构域，其他类型的肽也被用于KLAK的靶向改造。例如，通过噬菌体展示技术找到的特定靶向肽，如SMSIARL或CGRRAGGSC，已被用于靶向前列腺癌。此外，还有一些研究探索了使用其他结构域，如结合葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的肽，以提高KLAK的抗癌效果。这些研究不仅展示了KLAK/D-klak在不同癌症类型中的应用潜力，还揭示了其在体外和体内的效果。

为了提高KLAK的细胞内化能力，一些研究引入了非肽类的靶向结构域，如三苯基膦（TPP），它是一种常用的线粒体靶向配体。Kolevzon等人首次将TPP与D-klak结合，通过在赖氨酸的ε-氨基上连接TPP，提高了D-klak的细胞内化能力。Chen等人进一步研究了D-klak与叶酸的结合，叶酸能够靶向癌细胞，而TPP则引导肽进入线粒体。这种双靶向结构在多种癌细胞系中表现出显著的细胞毒性。

除了TPP，还有研究将KLAK与脂肪酸结合，形成具有两亲性的肽。例如，Stapp等人研究了KLAK与脂肪酸结合后形成的肽两亲体（peptide amphiphiles），这些结构能够自组装成圆柱形纳米纤维，不仅破坏线粒体膜，还能破坏癌细胞的细胞膜。这种纳米结构的引入提高了KLAK的细胞内化能力，并在体内实验中显示出更好的抗肿瘤效果。

另一项研究中，Rong等人将KLAK与氟烷基标签结合，使其能够自组装成纳米颗粒。这种结构在体外和体内实验中表现出更高的稳定性和细胞内化能力，以及更强的细胞毒性。该研究还展示了KLAK在乳腺癌模型中的应用效果。

Guo等人则采用了一种不同的策略，通过将KLAK与磷酸酪氨酸结合，使其能够在细胞膜上被碱性磷酸酶降解，从而自组装成纳米结构。这种结构能够诱导细胞膜的相分离，并最终破坏线粒体膜。实验结果显示，这种磷酸化肽在HeLa细胞中表现出更高的细胞毒性，并且在体内实验中有效抑制了肿瘤生长。

此外，Mei等人将KLAK与另一种化疗药物Lonidamide结合，通过引入一个自我组装的结构域，使其能够形成软水凝胶，用于药物输送。这种结构虽然机械性能较弱，但能够在谷胱甘肽（GSH）的作用下快速释放药物，并在体外和体内实验中显示出一定的抗癌效果。

Horton和Kelley等人通过替换KLAK中的赖氨酸为精氨酸，提高了肽的疏水性，从而增强了其对细胞膜的穿透能力。这种替换后的肽，如D-rlar，不仅在体外实验中表现出更高的细胞毒性，还在体内实验中显示出较好的抗肿瘤效果。此外，他们还研究了不同构型的肽，如D-klak的对映体，这些肽在细胞内化和线粒体靶向性方面表现出不同的特性。

总的来说，KLAK/D-klak的多种修改策略，包括与CPPs的融合、使用归巢结构域、引入非肽类靶向结构域、改变氨基酸组成等，都被用于提高其抗癌效果。这些策略不仅增强了KLAK/D-klak的细胞内化能力，还提高了其在不同癌症类型中的应用潜力。然而，尽管这些研究取得了显著进展，KLAK/D-klak仍未进入临床试验。未来的研究需要进一步探讨其在体内的稳定性和安全性，以及其在不同癌症类型中的特异性。此外，利用纳米药物输送系统可能会进一步推动KLAK/D-klak在临床中的应用。