来自日本冲绳地区人类患者的问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans）破坏上皮细胞屏障的独特机制

《PLOS Pathogens》：Distinct strategies of epithelial cell barrier disruption by Leptospira interrogans isolated from human patients in Okinawa, Japan

临床分离的钩端螺旋体Ok-strains通过破坏肾近端小管上皮细胞屏障，诱导细胞间连接蛋白E-钙粘蛋白、α-钙粘蛋白、afadin和nectin-2位移及F-actin解聚，其中Oki53主要依赖蛋白酶体和caspase通路降解afadin，而Oki65可能通过其他机制部分破坏屏障。

　　该研究聚焦于探讨日本冲绳地区分离的**钩端螺旋体**（*Leptospira interrogans*）临床分离株在人体肾近端小管上皮细胞（RPTECs）中引发感染机制的差异。钩端螺旋病是一种在全球范围内广泛存在的动物源性传染病，尤其在热带和亚热带地区更为常见。在冲绳，这种疾病的发生率相对较高，占日本所有病例的一半左右。尽管钩端螺旋体的致病性已被广泛研究，但冲绳地区的临床分离株的具体感染机制仍不明确。因此，本研究通过分析这些菌株对RPTECs的影响，揭示了它们如何通过不同的方式破坏上皮屏障，为未来防治策略提供了新的视角。

### 研究背景

钩端螺旋病由钩端螺旋体引起，其传播主要通过直接接触受污染的水或土壤，或通过动物尿液进入人体。在冲绳，夏季的河流活动是感染的主要途径，尤其是北部的冲绳本岛和屋久地区。尽管冲绳地区钩端螺旋体的发病率较高，但目前尚不清楚这些临床分离株是如何影响人体肾上皮屏障的。钩端螺旋体的致病机制通常涉及对上皮细胞连接蛋白和细胞骨架的干扰，从而破坏细胞间的屏障功能，导致组织损伤和系统性感染。因此，理解这些菌株在特定细胞类型中的作用机制，有助于揭示其致病性差异，并为针对性治疗提供依据。

### 研究方法与实验设计

本研究使用了从患者体内分离的11种钩端螺旋体临床分离株，其中部分属于**Hebdomadis**和**Pyrogenes**两个血清群。实验中，研究人员将这些菌株感染RPTECs，并通过**跨上皮电阻（TEER）**的测量来评估细胞间屏障的完整性。TEER是衡量上皮屏障功能的一个重要指标，通常用于检测细胞连接的稳定性。此外，研究人员还结合了**免疫荧光**和**免疫印迹**等技术，分析了连接蛋白（如E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、afadin和nectin-2）以及细胞骨架成分F-肌动蛋白的定位变化和表达水平。

为了进一步研究钩端螺旋体如何影响这些连接蛋白，研究人员使用了**蛋白酶体抑制剂**（如MG132和bortezomib）以及**泛半胱天冬酶抑制剂**（如Z-VAD-FMK）进行预处理，以观察这些抑制剂是否能够阻止钩端螺旋体诱导的屏障破坏。通过对比处理前后的TEER值和连接蛋白的定位，研究人员得以区分不同菌株的致病机制。

### 实验结果

实验结果显示，所有11种冲绳钩端螺旋体分离株在感染48小时后均导致TEER显著下降，表明它们都能破坏肾上皮屏障。其中，**Oki53**和**Oki65**是两种代表性菌株，分别属于**Pyrogenes**和**Hebdomadis**血清群。对这两种菌株的进一步研究发现，它们都能导致连接蛋白的位移和F-肌动蛋白的解聚，但具体的机制有所不同。

在Oki53感染的细胞中，使用蛋白酶体抑制剂和泛半胱天冬酶抑制剂后，TEER的下降、连接蛋白的位移以及afadin的降解均被有效阻止，这表明Oki53可能通过蛋白酶体和半胱天冬酶依赖的途径破坏上皮屏障。相比之下，Oki65感染的细胞中，这些抑制剂仅部分阻止了TEER的下降和afadin的降解，说明其可能利用了不同的机制。值得注意的是，Oki53感染的细胞在预处理后能够维持较高的TEER值，且连接蛋白和F-肌动蛋白的定位未发生显著变化，而Oki65感染的细胞则表现出部分维持的屏障功能，这提示两种菌株在破坏上皮屏障时存在不同的策略。

### 分析与发现

研究人员发现，**afadin**和**α-连环蛋白**在钩端螺旋体感染后均未出现蛋白水平的显著下降，但其定位发生了改变。这表明这些蛋白可能并未被降解，而是从细胞膜上被移除，从而影响了连接结构的稳定性。进一步的免疫荧光分析表明，Oki53和Oki65均能导致E-钙粘蛋白和α-连环蛋白的位移，但afadin的降解仅在Oki53中被明显观察到。这说明，afadin的降解可能是Oki53破坏上皮屏障的关键因素之一，而Oki65可能通过其他方式影响细胞连接。

此外，研究还发现，**F-肌动蛋白**的解聚是钩端螺旋体破坏上皮屏障的另一个重要特征。在Oki53感染的细胞中，使用蛋白酶体和半胱天冬酶抑制剂后，F-肌动蛋白的结构得到了一定程度的恢复，而在Oki65感染的细胞中，F-肌动蛋白的解聚并未完全被抑制。这表明，Oki53可能通过更直接的方式影响F-肌动蛋白的稳定性，而Oki65可能依赖于其他机制。

研究还指出，钩端螺旋体的不同菌株可能具有不同的**致病机制**。例如，某些菌株可能通过降解afadin来破坏nectin-afadin复合物，而另一些则可能通过其他方式影响连接蛋白的定位或功能。这些差异可能与菌株的**血清群**或**基因型**有关，也可能受到宿主细胞反应的影响。

### 讨论与意义

钩端螺旋体的致病性与其在宿主细胞内的活动密切相关。研究表明，某些菌株能够通过**蛋白酶体依赖**的途径诱导afadin的降解，进而破坏细胞连接和屏障功能。这种机制可能与菌株的**毒力因子**有关，如**VMPs（毒力修饰蛋白）**。VMPs是一类由钩端螺旋体分泌的蛋白，它们能够干扰宿主细胞的结构和功能，从而促进细菌的侵袭和扩散。

此外，研究还提到**Jarisch-Herxheimer反应（JHR）**，这是钩端螺旋病治疗过程中可能出现的一种不良反应，通常由抗生素引起的细菌裂解释放内毒素引发。在冲绳地区，JHR的发生率较高，甚至可能导致死亡。因此，研究中提到的**蛋白酶体抑制剂**可能为治疗提供新的思路。例如，**bortezomib**是一种已获批用于临床的蛋白酶体抑制剂，其可能在某些情况下作为抗生素的替代品，以减少JHR的发生。然而，由于其对不同菌株的疗效存在差异，仍需进一步的动物实验来验证其在体内的治疗潜力。

### 临床意义与未来研究方向

本研究首次揭示了冲绳地区的钩端螺旋体临床分离株在肾上皮细胞中的感染机制，并发现不同菌株可能通过不同的方式破坏上皮屏障。这些发现不仅有助于理解钩端螺旋病的致病性，也为开发新的治疗方法提供了线索。例如，通过靶向特定的蛋白酶体或半胱天冬酶，可以有效阻止某些菌株对上皮屏障的破坏，从而降低感染的严重程度。

然而，本研究也存在一些局限性。例如，研究人员未能获得这些菌株的**临床数据**，如肾功能指标或血液生化标志物，因此无法将TEER的变化与临床表现直接关联。此外，研究仅限于11种菌株，可能无法涵盖所有可能的致病机制。因此，未来的研究应扩大样本范围，包括更多不同血清群和基因型的菌株，以进一步揭示钩端螺旋体感染机制的多样性。

总的来说，这项研究强调了**钩端螺旋体感染机制的多样性**，并表明不同菌株可能通过不同的策略破坏上皮屏障。这种差异可能与菌株的**毒力因子**、**宿主细胞的反应**以及**基因背景**有关。未来的研究应进一步探索这些机制，并评估针对不同菌株的治疗策略，以提高钩端螺旋病的治疗效果和预防能力。