通过小RNA测序技术对库蚊（Culex tarsalis）的病毒组进行分析：一个因样本质量不佳而带来的挑战

《PLOS Pathogens》：Virome profiling of Culex tarsalis through small RNA-seq: A challenge of suboptimal samples

Culex tarsalis 是北美西尼罗病毒（WNV）的重要传播媒介，本研究通过sRNA测序技术分析其病毒组，发现7种 insect-specific viruses (ISVs)，其中Marma病毒和Culex narnavirus 1在5个州的17个采样点中普遍存在。尽管样本采集条件不理想（RIN值较低、运输延迟），但sRNA-seq仍能可靠检测病毒，并通过RT-PCR验证。研究揭示了ISVs在蚊媒体内的分布规律及其对脊椎动物病毒（如WNV）的影响潜力，证实了sRNA-seq在非标准样本中的适用性。

　　在本研究中，科学家们聚焦于一种名为 *Culex tarsalis* 的蚊子，这种蚊子广泛分布于北美地区，并且是西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）的重要传播媒介。为了更好地理解这种蚊子的病毒生态，研究团队采用了一种先进的技术手段——小RNA测序（small RNA sequencing, sRNA-seq），对来自美国西部五个州的17个地理区域的 *Culex tarsalis* 蚊群进行了病毒组分析。这一研究不仅揭示了这些蚊子中存在多种昆虫特异性病毒（insect-specific viruses, ISVs），还展示了即使在非理想条件下收集的样本，也能通过sRNA-seq技术获得有价值的病毒信息。

昆虫特异性病毒是一类仅能在昆虫体内复制、无法感染脊椎动物的病毒。尽管它们本身不会对人类造成直接威胁，但它们与能引起人类疾病的蚊传病毒（如WNV）之间可能存在复杂的相互作用。例如，某些ISVs已被发现能够通过降低病毒载量的方式，抑制WNV在蚊子体内的复制。这种机制可能对蚊子如何控制病毒传播具有重要意义。因此，了解 *Culex tarsalis* 的病毒组组成，有助于深入探讨这些病毒如何影响蚊子对病原体的防御能力，以及它们在蚊子与病毒之间的生态关系。

为了克服疫情期间样本采集和处理的困难，研究团队与蚊子控制机构合作，利用现有资源和方法收集了蚊子样本。由于疫情导致的物流和实验室操作限制，许多样本在运输过程中未能保持最佳的低温保存条件，这可能会影响RNA的完整性。然而，sRNA-seq技术的优势在于，小RNA在病毒感染期间天然富集，并且具有较高的稳定性，能够抵抗RNA酶的降解。因此，即使在RNA质量较低的情况下，该技术仍然能够有效识别病毒的存在。研究团队通过结合sRNA-seq与RT-PCR等方法，验证了所检测到的病毒，并成功地在多个样本中发现了多种ISVs。

研究结果显示，共有七种ISVs在 *Culex tarsalis* 中被检测到，这些病毒之前已被报道与该物种相关。其中，Marma病毒（MV）和 *Culex* 威尔逊病毒1（CN1）在所有五个州的样本中均有发现，显示出它们在该物种中的广泛分布。其他几种病毒则在特定州中被检测到，如Wuhan蚊子病毒6（WMV6）在四个州中被发现，而 *Culex* 棒状病毒2（CB2）和 *Culex* 部分病毒（PCMV）则在三个州中出现。最后， *Culex* 虫病毒4（CIV4）和湖北蚊子病毒4（HMV4）则在两个州中被检测到。这些病毒的共同特点是，它们均为RNA病毒，且仅在蚊子中被发现，尚未有确凿证据表明它们能感染脊椎动物。

研究团队还分析了这些病毒的sRNA特征，即病毒衍生的小RNA（vsRNA）的分布模式。大多数病毒的sRNA主要集中在21个核苷酸（nt）的长度范围内，这表明它们主要通过siRNA（小干扰RNA）途径进行防御反应。siRNA途径是蚊子抗病毒免疫系统中的关键机制，能够通过识别和切割病毒RNA来抑制其复制。然而，HMV4和CIV4的sRNA则显示出更强的piRNA（piwi-interacting RNA）特征，这表明它们可能激活了另一种抗病毒机制。piRNA通常来源于蚊子自身的基因组，特别是在某些特定的基因区域（称为piRNA簇），并且具有较长的长度（24–30 nt）。piRNA途径被认为在蚊子的长期和跨代免疫中发挥重要作用，尤其是在应对持续性病毒感染时。

通过sRNA-seq技术，研究团队不仅能够识别这些病毒的存在，还能够构建它们的sRNA图谱，并通过比较不同样本之间的sRNA分布模式，进一步分析病毒之间的共存关系。例如，他们发现某些病毒在多个样本中同时出现，这可能意味着这些病毒在特定的地理环境中具有较高的流行率。此外，他们还利用生物信息学工具，如Velvet和SPAdes，对sRNA数据进行拼接和分析，从而获得更完整的病毒基因组信息。尽管由于样本质量限制，拼接出的病毒序列长度较短，但这些数据仍然为研究蚊子病毒组提供了重要的基础。

值得注意的是，该研究的样本采集和处理条件并不理想，例如样本在运输过程中未经过严格的低温保存，导致RNA完整性可能受到影响。然而，研究团队利用sRNA的高稳定性，成功地从这些样本中提取并分析了病毒信息。这一发现具有重要的实际意义，因为它表明即使在现实世界的复杂条件下，如疫情限制，sRNA-seq仍然可以作为一种可靠的工具，用于病毒组的监测和研究。此外，该研究还强调了加强与蚊子控制机构的合作，以及改进样本保存和提取方法的重要性，以提高未来研究中病毒基因组的完整性，从而更全面地了解蚊子的病毒生态。

该研究的结果不仅加深了我们对 *Culex tarsalis* 病毒组的认识，也为未来的蚊子病毒研究提供了新的方向。例如，研究团队提到，虽然这些ISVs的宿主范围和对病毒复制的影响尚未完全明确，但它们可能在蚊子与病原体之间的相互作用中扮演重要角色。因此，进一步研究这些病毒如何影响蚊子对病原体的防御能力，以及它们在病毒传播中的潜在作用，将是未来的重要课题。此外，通过更广泛地收集和分析不同地区的蚊子样本，科学家们可以更好地了解病毒的地理分布和多样性，为公共卫生防控策略提供支持。

总的来说，这项研究通过结合先进的sRNA测序技术和严谨的生物信息学分析，揭示了 *Culex tarsalis* 病毒组的复杂性，并展示了即使在非理想条件下，也能获得有价值的病毒信息。研究团队的工作不仅为理解蚊子的抗病毒免疫机制提供了新的视角，也为未来的病毒监测和防控工作提供了技术上的支持和指导。此外，该研究还强调了在实际操作中，如何优化样本处理流程，以提高病毒基因组的完整性和分析的准确性。这些发现对于改善蚊子病毒的监测方法、提高病毒研究的效率，以及推动公共卫生领域的相关研究，具有重要的科学和应用价值。