综述：DNA组装策略的比较综述：从传统方法到现代技术

《Gene Reports》：A comparative review of DNA assembly strategies: From traditional to modern

DNA克隆技术从传统限制酶法到现代无缝组装策略（如金门组装、外切酶介导克隆）的演进及其在合成生物学中的应用。比较了限制酶克隆依赖性序列、引入非必要连接序列的缺陷，与无缝技术的精准性和多片段组装优势，并探讨了体外/体内克隆体系的效率与成本平衡。重点分析了表达载体与克隆载体的设计差异，及其在重组蛋白生产、CRISPR基因编辑（包括HDR和prime editing技术）和CAR-T细胞治疗等领域的应用。指出选择最优克隆策略需权衡序列依赖性、连接方式（有痕/无缝）、多片段整合能力及项目成本等因素。

　　分子克隆技术是现代生物技术中不可或缺的核心工具，广泛应用于DNA的扩增、表达和改造。随着生命科学研究的不断深入，传统的限制性内切酶克隆（REC）方法逐渐暴露出其局限性，例如对特定DNA序列的依赖性以及引入不必要的“疤痕”序列等问题。这些问题促使了更为先进和高效的DNA组装策略的出现，为合成生物学、基因治疗和细胞疗法等领域的复杂项目提供了更优的选择。

在本文中，我们将系统地回顾和分析主要的DNA克隆技术，从早期的方法到现代的无缝组装和体内组装系统。我们还将探讨克隆载体与表达载体之间的基本区别，前者主要用于DNA的扩增和在宿主细胞中的稳定维持，而后者则包含调控元件，用于驱动重组蛋白的表达或指导RNA（gRNA）的转录，以满足细胞治疗的需求。此外，我们还将描述每种方法的机制和相关酶，并评估它们在不同应用场景中的关键优势与局限性。

分子克隆的基本原理在于将目标DNA片段（即“插入”）引入一个可以自我复制的DNA分子——载体，通常是质粒。这种重组DNA分子随后被导入宿主细胞，如大肠杆菌（*E. coli*），并在宿主基因组的复制过程中生成多个目标DNA的拷贝。分子克隆的出现彻底改变了生物学研究，使得科学家能够从复杂的基因组中精确地分离和高效地扩增单个基因，这是过去难以实现或几乎不可能完成的任务。20世纪60年代末至70年代初的关键科学发现，为分子克隆技术的发展奠定了基础。

1967年，DNA连接酶的发现为DNA片段的连接提供了必要的酶学工具。多个实验室在这一时期都独立发现了DNA连接酶，这使得DNA片段的连接成为可能。随后，Werner Arber、Hamilton Smith和Daniel Nathans在1970年代初发现了并表征了II型限制性内切酶，例如HindII，这些酶能够在特定的DNA序列处进行精确切割，这一突破性发现为基因工程的发展铺平了道路，并使他们获得了1978年的诺贝尔奖。1972年，Paul Berg在体外将病毒和噬菌体DNA结合，创造了第一个重组DNA分子，但该分子无法在活细胞中复制。1973年，Cohen和Boyer的合作标志着基因工程的重要进展：他们使用*Eco*RI将质粒DNA切割并连接，成功地将重组质粒导入*E. coli*，展示了DNA在活细胞中的稳定复制和遗传。这一实验被广泛认为是现代基因工程的起点，并推动了生物技术产业的兴起。

DNA克隆技术在合成生物学中扮演着至关重要的角色，尤其在医学和诊断领域。其中，一个重要应用是重组蛋白的生产，包括生长因子、生长激素以及参与人类代谢的信号分子（如蛋白激酶C），还有细胞因子如IL-6、IFN-γ和IL-17，以及治疗性药物如单克隆抗体（例如抗CD20）和疫苗。这些应用通常通过构建表达载体并将其导入合适的宿主系统来实现，如大肠杆菌、酵母（*Saccharomyces cerevisiae*和*Pichia pastoris*）、昆虫细胞（通过杆状病毒系统）或哺乳动物细胞系如CHO或HEK293。此外，DNA克隆还被用于蛋白质的结构和功能研究，通过克隆、表达和大量纯化目标基因，使得科学家能够利用X射线晶体学或冷冻电镜技术解析三维结构，并阐明其作用机制。

另一个关键应用是设计用于CRISPR-Cas9基因编辑的载体。这些载体通常包含启动子、Cas9基因（或Cas9 mRNA）、gRNA或pegRNA cassette，以及在必要时的标记或报告基因。这些载体可以是质粒或病毒载体（如慢病毒、逆转录病毒），用于基因治疗或细胞治疗。例如，使用gRNA和同源供体模板的HDR系统，以及基于pegRNA的原位编辑技术，已被开发用于纠正某些突变，如囊性纤维化中的CFTR F508del突变或镰状细胞贫血中的HBB突变。许多研究还采用体外方法，即从患者体内提取细胞，在体外进行编辑后再将其重新植入体内。

传统限制性内切酶和连接酶克隆方法的局限性，如多步骤操作、对可用限制位点的依赖以及引入不必要的“疤痕”序列，推动了更为高效、灵活和经济的方法的出现，如黄金门组装（Golden Gate Assembly）、TA/TOPO-TA?克隆、Gateway?克隆和基于外切酶的无缝克隆（ESC）技术。每种方法都有其独特的优缺点，受到诸如位点依赖性、“疤痕”形成、操作复杂性、多片段组装能力以及总体成本等因素的影响。值得注意的是，ESC技术包含多种变体，它们在酶学成分和基本机制上有所不同，涵盖了体外和体内策略，从而影响了克隆效率和成本。

在实验室规模的克隆过程中，灵活性是一个关键因素。例如，Gateway?克隆和TOPO-TA?克隆方法需要使用商业化的载体，这些载体包含特定的*att*重组位点或（T）突出端。由于这些载体在大多数实验室中难以进行定制设计，因此这两种方法相对缺乏灵活性，成本较高，且对小型实验室来说不够容易获得。此外，传统的限制性内切酶克隆（REC）方法在操作过程中同样面临诸多挑战，如需要特定的限制酶、连接效率较低以及可能引入不必要的“疤痕”序列。

因此，本文强调了选择合适克隆策略的重要性，应根据项目的具体需求，权衡连接类型（有疤痕/无缝）、序列依赖性、多片段组装能力、灵活性和成本等因素，以满足不同实验的需求。随着技术的不断进步，越来越多的新型克隆方法被开发出来，以适应不同应用场景的需求。这些方法不仅提高了克隆效率，还减少了操作步骤，降低了成本，并提供了更高的精确度和灵活性。在合成生物学、基因治疗和细胞疗法等领域，这些技术的进步使得科学家能够更高效地构建复杂的基因电路和治疗性基因载体。

综上所述，DNA克隆技术作为许多生命科学研究和生物医学应用的基础，具有广泛的应用价值。无论是用于基础研究中的基因功能分析，还是用于临床应用中的治疗性蛋白生产，亦或是用于基因编辑的载体构建，DNA克隆技术都发挥着至关重要的作用。然而，随着研究的深入，传统方法的局限性逐渐显现，推动了新型克隆策略的发展。这些策略在不同方面表现出各自的优劣，使得科学家可以根据实际需求选择最适合的克隆方法。在未来，随着生物技术的进一步发展，DNA克隆技术将继续演进，为科学研究和医学进步提供更加精准、高效和经济的解决方案。