关于印度坎巴特湾太阳能盐田中细菌多样性的初步报告，采用16S扩增子测序技术

《Heliyon》：A preliminary report on bacterial diversity in solar salterns located at the Gulf of Khambhat, India using 16S amplicon sequencing

本研究通过16S rRNA测序和MG-RAST、One Codex分析，探究了印度Khambhat地区三个盐池（盐度8.3%、12.06%、19.91%）的产盐微生物多样性，发现低盐池以细菌为主，高盐池出现古菌，盐度梯度显著影响微生物组成，为极端环境微生物研究提供新数据。

　　本研究聚焦于印度古吉拉特邦Khambhat地区的太阳能盐田，旨在通过高通量测序技术揭示其盐渍土壤中原核生物的多样性。盐田作为人工构造的高盐环境，不仅在盐业生产中发挥着重要作用，还为研究极端环境微生物提供了独特的机会。盐田的土壤环境具有显著的盐度梯度，这一特性使得其成为研究微生物群落如何适应不同盐度条件的理想场所。随着对微生物在生态系统中作用的认识不断加深，研究其组成和功能变得愈发重要，尤其是在极端环境如高盐度区域。

盐田土壤的微生物群落与周围环境密切相关，其组成不仅受到盐度的影响，还可能受到其他物理化学参数以及人为活动的干扰。在本研究中，我们选择了三个不同盐度的盐田池塘P1、P2和P3，它们分别具有8.3%、12.06%和19.91%的盐度。通过对这些样本进行16S rRNA扩增子测序，并结合两种在线分析平台——MG-RAST和One Codex，我们得以全面了解盐田土壤中微生物的分布情况。这一方法避免了传统培养法的局限性，能够更准确地反映真实环境中的微生物多样性。

研究结果表明，P1和P2的土壤样本主要由细菌组成，其中P1中91.95%的序列属于细菌，且其中53.35%归为 Firmicutes；P2中59.65%为细菌，46.27%为 Euryarchaeota。相比之下，P3的土壤样本中细菌占比高达88.26%，但同时也存在 Euryarchaeota，表明其盐度更高，有利于某些古菌的生长。此外，多个常见的原核生物门类在所有样本中均有出现，包括 Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Verrucomicrobia 和 Euryarchaeota，这些门类的微生物在工业和生态应用中具有重要价值。例如，某些 Firmicutes 和 Proteobacteria 菌种已被广泛用于生物降解、生物修复和酶生产等领域。

盐田的物理化学特性对微生物群落的组成具有显著影响。通过分析样本的pH值、盐度、总碳含量、总氮含量等参数，我们发现这些因素在不同盐田池塘之间存在差异。P1、P2和P3的pH值分别为7.37、7.20和6.52，而盐度则呈现出递增趋势。低盐度环境可能更适合某些细菌的生长，而高盐度则促进了古菌的繁衍。同时，土壤中的有机质含量较低，这可能限制了微生物的代谢活动，影响其功能表现。此外，氮含量的不足可能对土壤肥力产生负面影响，进而影响植物的生长，这也是盐田地区植被稀少的一个重要原因。

为了获取土壤中的环境DNA（eDNA），我们使用了QIAGEN、ZYMO RESEARCH和THERMOFISHER等商业提取试剂盒，并结合PCR技术对V3-V4区域进行扩增。随后，我们利用Illumina MiSeq平台完成测序，并通过FastQC、Trimmomatic、Unicycler等工具进行数据处理和质量控制。这些步骤确保了测序数据的准确性，并为后续的分类和功能分析奠定了基础。经过质量控制后，样本的序列数量和碱基对数有所减少，但依然保留了足够的信息用于微生物群落的分析。

在数据处理过程中，我们使用了两种不同的分析平台。MG-RAST作为一个开放源代码的平台，能够进行更为全面的分类和功能分析，其优势在于可以比较序列到多个数据库，如RefSeq、SEED和KEGG，从而提供更深入的生态和代谢功能信息。而One Codex则专注于快速、高置信度的分类，其基于k-mer的算法使得分类更加高效。两种平台的结果相互补充，为研究提供了多角度的视角。在P1和P2样本中，主要的微生物门类为细菌，而P3样本则显示了更显著的古菌比例，这与盐度的梯度变化相一致。

通过Krona图的可视化分析，我们进一步明确了不同样本中微生物的分布情况。图中显示，P1和P2样本中细菌占主导地位，其中 Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria 和 Verrucomicrobia 是主要的门类。而在P3样本中，Euryarchaeota的出现表明该区域的盐度更高，可能更适合某些古菌的生存。值得注意的是，一些特定的菌属，如 Haloarcula、Halorientalis 和 Halorhabdus，在P3中出现，而在P1和P2中则未被检测到。这些菌属通常与高盐度环境相关，说明盐度的增加可能促使某些微生物的迁移或繁殖。

研究还揭示了不同盐田池塘之间微生物组成的差异。P1和P2的微生物群落显示出较高的相似性，而P3则表现出独特的多样性。这种差异可能与盐田的地理位置和盐度梯度有关。P1和P2位于靠近人类居住区的位置，可能受到人为活动的影响，如动物排泄物或灌溉水的引入，这可能导致了某些与动物相关或肠道菌群相关的微生物的出现。相比之下，P3距离人类活动较远，且盐度更高，因此其微生物群落可能更加依赖于自然环境的条件。

本研究的意义在于，它不仅提供了关于Khambhat盐田微生物群落的初步认识，还强调了非培养方法在研究极端环境微生物中的重要性。传统培养方法虽然在某些情况下有效，但无法全面反映环境中的微生物多样性，尤其是在高盐度条件下，许多微生物无法在实验室环境中生长。因此，采用高通量测序和环境DNA分析的方法，能够更准确地捕捉到这些微生物的存在，并为后续的生态功能研究提供数据支持。

此外，研究结果还表明，盐田中的微生物可能在工业和生态方面具有重要价值。例如，某些菌种能够产生对工业生产有用的酶，如β-半乳糖苷酶、谷氨酰胺酶、淀粉酶和尿素酶，这些酶在生物技术领域有着广泛的应用。同时，这些微生物在高盐度环境下的适应能力也为研究微生物的耐盐机制提供了线索。理解这些机制不仅有助于揭示微生物的生存策略，还可能为生物技术开发提供新的思路，如利用耐盐微生物进行生物降解、生物修复或工业酶的生产。

本研究还指出了当前研究的一些局限性。首先，它主要关注细菌的多样性，而忽略了病毒、真菌和古菌等其他微生物群体。其次，由于样本仅在单一季节采集，因此无法全面反映微生物群落的季节性变化。未来的研究可以考虑在多个季节进行采样，以更全面地了解微生物群落的动态变化。此外，结合宏基因组测序和功能基因分析，可以进一步揭示微生物在盐田中的生态功能和代谢潜力。

总之，Khambhat地区的盐田土壤为研究高盐度环境下的微生物提供了宝贵的样本。通过非培养方法，我们得以发现许多在传统方法中难以识别的微生物群体，这不仅拓展了我们对盐田微生物多样性的理解，也为相关领域的研究提供了新的方向。随着对微生物群落的深入研究，我们有望更好地利用这些微生物资源，推动生物技术的发展，并为生态环境的管理和保护提供科学依据。