ScentChrono：一种用于研究花卉挥发性物质节律与传粉者相互作用的计算流程

《Heliyon》：ScentChrono: A computational pipeline for floral volatile rhythms and pollinator interactions

花卉挥发性有机化合物（VOCs）的动态分析及与传粉者活动关联研究。开发了ScentChrono计算流程，整合GC-MS数据聚类与昼夜节律建模，显著提升挥发性化合物检测精度和生态关联性分析能力。通过Brassicales科植物Erucaria microcarpa案例，验证ScentChrono较传统方法RAMClust具有更高灵敏度（0.64 vs 0.38）和精准度（0.64 vs 0.23），并鉴定出9种具有显著昼夜波动特征（如苯甲醛、甲基苯甲酸）的活性VOCs，其排放峰与蜜蜂、鞘翅目等传粉者活动高峰（12:00-14:00）高度同步。提出基于负向控制与时间模式融合的代谢组学分析框架。

　　花香在植物与传粉者互动中扮演着至关重要的角色，不仅影响传粉者的访问频率，还对植物的繁殖成功率产生深远影响。植物释放的挥发性有机化合物（VOCs）不仅构成了花香的基础，还可能独立于人类感知，吸引昆虫。这些化合物的释放通常遵循昼夜节律，与传粉者活动时间高度一致。因此，理解这些时间变化的释放模式对于将花香动态与传粉者行为联系起来，并最终揭示植物繁殖机制具有重要意义。

在研究花香变化的过程中，采样和分析方法面临诸多挑战。传统的静态或动态顶空技术能够更有效地保留花香的复杂性，相较于溶剂提取等其他方法，更能减少对花香成分的破坏。然而，随着数据的积累，分析这些高分辨率、复杂的数据集变得愈发困难。Gas Chromatography–Mass Spectrometry（GC–MS）作为一种高度敏感的分析手段，能够生成数千次扫描数据，其中包含多个光谱信号。这使得花香分析变得更为精细，但也增加了数据解读的复杂性。为了提升分析的准确性，研究人员通常采用两种策略：一种是无靶向分析，其特点是探索性强且对先验知识要求较低；另一种是靶向分析，依赖于参考标准、Kovats指数和光谱库。虽然靶向分析提高了准确性，但它也容易捕捉到非花香成分，如代谢产物和环境污染物。因此，过滤这些信号对于提高分析的精确度至关重要，但这一过程往往需要专业知识和大量时间。

为了应对这些挑战，研究团队开发了一种名为ScentChrono的计算流程，它将挥发性特征聚类与时间排放模式相结合。ScentChrono通过引入负控样品来减少背景信号的干扰，并显式建模昼夜节律，使得花香分析能够更精确地与传粉者活动相关联。这一方法在对一种广泛分布于以色列干旱地区的植物Erucaria microcarpa（十字花科）进行测试时，显示出比常用的代谢组学聚类工具RAMClust更高的灵敏度、精确度和一致性。在靶向分析中，研究人员检测到了18种挥发性化合物，而ScentChrono则识别出14种与时间排放模式一致的化合物。其中，9种化合物，包括苯甲醛、甲基苯甲酸和苯乙酸乙酯，同时被两种方法识别，并且表现出明显的昼夜节律，其排放高峰与传粉者活动高峰一致。

这一研究不仅验证了ScentChrono在花香分析中的有效性，还揭示了花香成分与传粉者行为之间的潜在联系。通过ScentChrono，研究人员能够更全面地识别花香成分，并且分析它们在不同时间点的动态变化。这种时间同步的分析方法对于理解花香如何塑造传粉者行为具有重要意义，为植物与传粉者之间的生态互动提供了新的视角。此外，ScentChrono的引入也为生态学研究提供了一种更可靠和高效的工具，有助于揭示花香在生态系统中的作用，从而支持生物多样性保护和可持续农业的发展。

在实验设计方面，研究团队选择了Erucaria microcarpa作为研究对象，因其在干旱地区广泛分布，且其花香具有明显的昼夜节律。采样地点位于以色列的Midreshet Ben-Gurion，研究团队在两个连续的日期，每隔3小时采集一次花香样本，确保数据的全面性和时间分辨率。为了减少因采样造成的伤口诱导排放，实验在采样后至少一小时才开始进行。在采集过程中，使用了动态顶空技术，确保挥发性成分的完整保留。采集后的样品经过处理，包括用正己烷提取并加入内标物，以提高检测的准确性。

在数据处理阶段，研究团队采用了XCMS在线分析工具，对采集的GC–MS数据进行处理。处理过程包括峰检测、跨样本的峰分组、保留时间对齐和缺失峰的强度校正。所有分析均采用多组分析选项，以确保数据的全面性。此外，研究团队还使用了Flower–Blank Ratio来区分花香成分与背景信号，这一指标通过比较花香样品和空白对照样品的特征强度，有助于排除环境干扰。

在聚类分析中，ScentChrono结合了多种算法，包括Louvain和Infomap，这两种算法在网络聚类分析中已被证明是有效的。为了进一步细化聚类结果，研究团队还应用了DBSCAN算法，基于保留时间（RT）对特征进行分组。这种多阶段的聚类方法不仅提高了花香成分识别的准确性，还确保了分析结果在不同时间点的一致性。

在结果分析中，研究团队发现ScentChrono在多个方面优于RAMClust。在检测到的花香成分中，ScentChrono能够更准确地识别与传粉者活动同步的化合物，从而提高了结果的生态相关性。此外，ScentChrono在两个连续的采样日中展现出更高的聚类一致性，这一特性对于长期监测和跨季节比较尤为重要。通过比较不同聚类方法的性能指标，研究团队发现ScentChrono在精度和召回率方面均优于RAMClust，表明其在花香分析中的优越性。

在传粉者观察方面，研究团队在Midreshet Ben-Gurion的开放田地进行了详细的调查，记录了不同时间段内的传粉者访问情况。调查结果显示，Hymenoptera（膜翅目昆虫）是访问Erucaria microcarpa的主要传粉者，其次是Diptera（双翅目昆虫）、Coleoptera（鞘翅目昆虫）和Lepidoptera（鳞翅目昆虫）。这些数据与花香成分的排放时间高度一致，表明花香在吸引传粉者方面起到了关键作用。

此外，研究团队还分析了不同花香成分与传粉者活动之间的相关性。例如，苯乙酸乙酯（cluster 3）的排放高峰与传粉者活动高峰一致，而苯甲醛、甲基苯甲酸和苯乙腈（cluster 2）的排放模式也与传粉者活动高度相关。这些结果进一步支持了花香作为生态信号在植物与传粉者互动中的重要性。同时，研究团队还发现了一些可能具有生态功能的化合物，如水杨酸甲酯（methyl salicylate），其不仅可能作为防御信号，也可能在吸引传粉者方面发挥作用。

研究团队还讨论了ScentChrono在花香分析中的优势。通过结合负控样品和时间过滤，ScentChrono能够更有效地隔离生物信号，减少背景噪声的干扰。这一方法不仅提高了分析的准确性，还增强了对花香成分时间变化的理解。此外，ScentChrono在两个连续的采样日中展现出更高的聚类一致性，这表明其在长期研究中的稳定性。

ScentChrono的应用还揭示了花香成分与传粉者行为之间的复杂关系。例如，苯乙腈（benzyl nitrile）和苯甲醛（benzaldehyde）属于同一生物合成途径，它们的协同释放可能有助于吸引特定的传粉者群体。而水杨酸甲酯（methyl salicylate）虽然主要与防御相关，但在某些情况下也可能对传粉者产生影响。这些发现不仅加深了对花香生态功能的理解，还为未来的植物-传粉者互动研究提供了新的思路。

总的来说，ScentChrono作为一种新的计算流程，为花香分析提供了一种更全面和高效的方法。它不仅能够识别花香成分，还能揭示其时间变化模式，从而更好地理解花香如何影响传粉者行为。这种时间同步的分析方法对于生态学研究具有重要意义，特别是在探讨花香在生态系统中的作用时。未来的研究可以进一步探索ScentChrono在不同植物物种和生态条件下的适用性，以及如何将其应用于更广泛的生态和农业研究中，以促进生物多样性保护和可持续农业的发展。