使用标准Fmoc/tBu保护的氨基酸进行的水相固相肽合成（ASPPS）

《ACS Sustainable Chemistry & Engineering》：Aqueous Solid-Phase Peptide Synthesis (ASPPS) using Standard Fmoc/tBu-Protected Amino Acids

水相固相多肽合成（ASPPS）通过优化水-IPA混合溶剂系统及反应条件，实现了标准Fmoc氨基酸的稳定缩合与高效去保护，解决了β-消除产物和肽链聚集问题，成功合成 Angiotensin II Analog 和 Tirzepatide 等长链肽，验证了该方法在规模化生产中的可行性和环保优势。

　　随着环境问题的日益突出和相关法规的逐步收紧，合成肽化学领域正逐渐将目光投向绿色化学方向。传统的固相肽合成（SPPS）方法虽然在研究和工业中被广泛使用，但其对有害溶剂的依赖，尤其是N,N-二甲基甲酰胺（DMF），给可持续性和安全性带来了显著挑战。尽管已有多种尝试用更环保的溶剂或溶剂混合物替代DMF，但在合成中等至大型肽时仍存在诸多限制。水相固相肽合成（ASPPS）作为一种有前景的替代方案，其发展受到了溶剂中保护基团溶解度差和新型水溶性保护基团稳定性不足等问题的阻碍。近期，随着更易溶的保护氨基酸和Fmoc氨基酸纳米颗粒的出现，ASPPS在一定程度上克服了这些障碍，但仍需要特定的保护氨基酸或非标准操作。本文提出了一种全新的ASPPS策略，该策略在很大程度上借鉴了传统SPPS的方法，但在整个过程中使用水作为主要溶剂，实现了更环保的肽合成。

在绿色化学的概念提出后，合成肽化学领域对其关注并不如其他领域。然而，近年来由于社会对可持续发展的重视，以及政府对某些有害试剂和溶剂的使用限制，这一领域开始受到更多关注。例如，欧盟自2023年12月12日起，禁止DMF的制造、使用或销售，除非其暴露水平被严格限制。此外，随着基于肽的药物如GLP-1和GIP激动剂（如利拉鲁肽、塞马鲁肽和替扎肽）的广泛应用，推动了肽合成领域对绿色化学的进一步研究。这些药物的生产规模从最初的克级扩大到吨级，对原料消耗、反应试剂和副产物的处理与处置提出了更高的要求。

固相肽合成（SPPS）由诺贝尔奖得主R. Bruce Merrifield首次提出，至今仍是研究和工业中合成肽的首选方法。然而，从可持续性的角度来看，SPPS面临的主要问题在于反应试剂的过量使用及其去除过程需要大量的洗涤步骤。尽管欧盟对DMF的使用进行了限制，但其仍然是SPPS的首选溶剂。尝试用单一溶剂替代DMF的方案均未取得成功，N-丁基吡咯烷酮（NBP）虽然接近成功，但其高粘度使得性能略逊于DMF。不过，在40 °C的轻微加热条件下，NBP能够实现令人满意的结果。然而，欧盟预计最终将限制所有含酰胺的溶剂使用。因此，一些比DMF更环保的溶剂被测试过，如乙腈（ACN）、四氢呋喃（THF）、2-甲基四氢呋喃（Me-THF）、环戊基甲醚（CPME）、γ-戊内酯（GVL）、N-甲酰吗啡啉、丙烯碳酸酯（PC）、N-辛基吡咯烷酮（NOP）、茴香醚、PolarClean、二丙二醇二甲醚（DMM）和三乙基磷酸酯（TEP）。尽管这些溶剂在合成小肽方面表现出色，但在中等至大型肽的合成中仍面临挑战。

鉴于单一溶剂难以完全替代DMF，多个研究团队提出了设计模仿DMF物理特性的溶剂混合物。例如，有研究建议使用NBP-乙酸乙酯（EtOAc）混合物、Cyrene、硫酚烷、茴香醚、二甲基亚砜（DMSO）与EtOAc或1,3-二氧环戊烷（DOL）的混合物、DMSO-n-丁基乙酸酯（AcOBu）混合物、NOP-茴香醚混合物、DMSO-异丙醇（IPA）混合物或DMSO-TEP混合物。这些混合物在多数情况下表现出优于单一溶剂的性能，并且在某些情况下能够实现与DMF相当的中等至大型肽合成效果。

尽管水被认为是绿色溶剂的典范，但其在SPPS中的应用相对较少。在溶液肽化学中，尽管Lipshutz等人和一些其他研究者对此进行了深入研究，但中等至大型肽的合成进展有限。近期的综述文章对这一领域的研究进行了总结，揭示了当前研究的不足之处。

早期的ASPPS研究主要集中在开发新的保护基团，以增强保护氨基酸在水相中的溶解度。Hojo和Kawasaki的研究在这一方面具有开创性意义，他们提出了一系列含有磺??或磺酸盐的β取代乙氧基羰基保护基团。这些保护基团通过β-消除反应去除，但其在脱保护过程中对二级胺的不稳定性以及在逐步合成过程中的稳定性不足，影响了最终肽的纯度。随后，Kolmar及其团队受Merrifield研究的启发，开发了二磺基Fmoc（Smoc）作为Fmoc保护基团的替代方案，用于溶解Fmoc保护的氨基酸。通过Smoc氨基酸，该团队成功合成了具有可接受纯度的肽。

尽管Smoc氨基酸在商业上可获得，但完全取代传统且广泛应用的Fmoc氨基酸仍是一个遥远的目标。此外，除了标准的蛋白氨基酸，还需要合成D-氨基酸以及大量天然和非天然氨基酸，以满足治疗肽的合成需求。因此，许多研究仍然聚焦于使用标准的Fmoc氨基酸。Hojo和Kawasaki的团队提出了使用水分散性的Fmoc氨基酸纳米颗粒，通过球磨粉碎法与ZrO珠和PEG作为分散剂来制备。这种方法在一些研究中被用于合成模型肽，并且在某些情况下通过微波加热提升了合成效果。此外，我们的团队也使用了微波辅助的自动合成器，结合标准的Boc氨基酸进行ASPPS。Collins等人则使用了微波辅助的自动合成器与1,1-二氧杂苯并[b]噻吩-2-基甲氧基羰基（Bsmoc）氨基酸进行ASPPS。Bsmoc作为一种α,β不饱和磺酮基保护基团，比Fmoc更具水相化学的兼容性，其曾一度接近商业化，但其推广过程中面临诸多挑战。

Pawlas和Rasmussen是最早提出使用标准Fmoc氨基酸进行ASPPS的研究者之一。他们使用了H2O-PolarClean（4:1）作为溶剂，并结合TCFH/二甲基乙醇胺（collidine）作为偶联方法，成功合成了Leu-enkephalineamide。所有研究团队均使用了亲水性树脂，如基于PEG的树脂（如Tentagel、PEG和ChemMatrix）。

本文提出了一种新的ASPPS策略，旨在尽可能模拟传统SPPS方法，但全部在水相中进行。该方法使用标准Fmoc氨基酸、水溶性碳二亚胺（如EDC·HCl、TBDC·HCl）、哌啶（PIP）或4-甲基哌啶（MePIP）作为Fmoc去除试剂，并结合ACN、TEP和IPA作为共溶剂，以提升反应效率。

在实验验证过程中，研究人员首先筛选了α-氨基酸保护基团、树脂、偶联试剂和共溶剂。最终选择的共溶剂包括ACN、TEP和IPA，它们在价格和大规模供应方面具有优势。实验表明，PIP和MePIP在去除Fmoc保护基团方面优于1 M NaOH，尽管后者能够有效去除保护基团，但会导致最终肽的纯度下降。此外，哌嗪（PZ）也被提出作为PIP的替代物，但其在水相中的溶解性优于DMF中的PIP。PZ在ASPPS中的应用被测试，结果显示其在水相中对Fmoc的去除效果不如PIP。因此，最终决定采用PIP作为Fmoc去除试剂。

为了提升水相中的反应效率，研究人员测试了不同溶剂混合物，包括H2O-ACN和H2O-TEP（80:20）。实验发现，这些混合物能够有效去除Fmoc保护基团，并在某些情况下产生沉淀物，可能是由于DBF-PIP加合物的形成。然而，通过使用0.2 M HCl在H2O-TEP或IPA中进行洗涤，可以有效去除这些沉淀物。因此，在水相中去除Fmoc后，通常采用IPA洗涤。

在合成模型肽Leu-enkephalin amide（H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-NH2）时，研究人员采用H2O-TEP或H2O-ACN（80:20）作为溶剂，结合标准Fmoc氨基酸和水溶性碳二亚胺进行偶联反应。所有实验均采用亲水性树脂（如PG树脂）进行，并在室温下进行。实验结果显示，这些条件能够有效合成目标肽，并且纯度良好。此外，使用IPA作为共溶剂的实验也显示出良好的效果，尽管其纯度略低于TEP。

为了进一步优化反应条件，研究人员测试了不同的偶联条件，包括使用不同的偶联试剂和延长反应时间。实验发现，所有偶联条件在H2O-IPA（60:40）中均表现出良好的效果，尽管部分条件在去除Fmoc保护基团时仍需延长反应时间。此外，一些实验还测试了不同的温度条件，如45 °C，以提升反应效率。实验表明，这些条件在合成中等至大型肽时能够有效提升纯度。

在合成包含Asp和Asn残基的肽时，研究人员发现β-肽（即通过形成aspartimide）在水相中更容易形成。因此，对于这类肽，建议使用50%的MOR在H2O-IPA（60:40）中进行Fmoc去除，以减少β-肽的形成。实验表明，这种方法在45 °C下进行2小时，能够有效去除Fmoc保护基团，而不会形成β-肽。

此外，研究人员还测试了不同比例的IPA和TEP混合物，以评估其对不同肽合成的影响。实验发现，IPA在成本和可得性方面优于TEP，但其在某些情况下可能不如TEP有效。因此，选择合适的溶剂比例和条件对于提升肽的纯度至关重要。

在合成Angiotensin II类似物（H-Asp-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-NH2）时，研究人员采用了TG树脂（含有更多PEG，因此具有较低的载量能力）和PG树脂（载量能力较高）。实验发现，使用H2O-IPA（60:40）作为溶剂，能够有效合成目标肽，并且纯度较高。此外，实验还测试了不同反应时间和温度条件，以优化合成过程。

最终，研究人员对ACF（65-74）（H-Val-Gln-Ala-Ala-Ile-Asp-Tyr-Ile-Asn-Gly-NH2）进行了合成，采用H2O-IPA（60:40）作为溶剂，并结合标准Fmoc氨基酸、水溶性碳二亚胺和偶联试剂进行反应。实验表明，这种方法能够有效合成该肽，并且纯度较高。此外，研究人员还测试了不同反应条件，包括使用不同的偶联试剂和延长反应时间，以进一步优化合成效果。

综上所述，本文提出了一种新的ASPPS策略，能够有效合成中等至大型肽，并且在环境友好性和经济性方面具有显著优势。该方法使用标准Fmoc氨基酸和亲水性树脂，结合水溶性碳二亚胺和适当的共溶剂，能够实现高纯度的肽合成。尽管水相反应的效率可能低于传统有机溶剂，但通过优化反应条件和选择合适的试剂，可以显著提升合成效果。此外，研究还强调了在ASPPS过程中处理水相废物的重要性，以及在某些地区水资源稀缺的背景下，水的使用需要更加谨慎。未来的研究应进一步探索如何在水相中实现更高效的肽合成，并减少对环境的影响。