FTO-ACKR3轴通过AhR介导的m6A RNA甲基化调节多环芳烃诱导的哮喘发作

《Environment & Health》：FTO-ACKR3 Axis Regulates Polycyclic Aromatic Hydrocarbons-Induced Asthma Attacks via AhR-Mediated m6A RNA Methylation

PAHs通过激活AhR抑制FTO表达，导致m6A水平下降，稳定ACKR3 mRNA并激活自噬和炎症通路，加剧哮喘和肺纤维化。

　　空气污染对人类健康的影响日益受到关注，尤其是在呼吸系统疾病方面。近年来，研究发现空气中的多环芳烃（PAHs）与哮喘的发作和加重之间存在显著关联，但其具体的分子机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨PAHs如何通过表观转录调控机制促进哮喘的发展，并揭示其中的关键信号通路和靶标分子，从而为环境污染相关的哮喘治疗提供新的思路。

### 研究背景与意义

空气污染，尤其是细颗粒物（PM2.5），是全球范围内严重的公共卫生问题。据估计，世界上超过99%的人口暴露在超过世界卫生组织（WHO）推荐标准的PM2.5浓度环境中。PM2.5中含有多种有毒成分，其中PAHs因其致突变性和致癌性而备受关注，它们与肺部疾病，包括哮喘、肺纤维化和慢性阻塞性肺疾病（COPD）密切相关。哮喘作为一种全球性慢性疾病，影响着超过3亿人，而PM2.5和PAHs的暴露已被证明会加剧其症状。然而，关于PAHs如何引发哮喘以及恶化其症状的具体机制，目前仍存在许多未知。

肺部上皮细胞作为空气污染的第一道防线，其功能受到多种环境因素的影响。PAHs能够破坏上皮细胞中的紧密连接蛋白，促进炎症反应。尽管如此，目前对于PAHs在哮喘中的作用机制仍缺乏系统性的研究。表观遗传学修饰，特别是RNA甲基化（m6A），在肺部发育和疾病中发挥着重要作用。m6A的调控涉及“写入者”（如METTL3）、“擦除者”（如FTO）和“阅读者”蛋白，它们共同影响mRNA的稳定性和翻译效率。虽然m6A的异常已被证实与肺癌和肺纤维化有关，但其在PAHs引发哮喘中的作用尚不清楚。

最近的研究提示，芳香烃受体（AhR）在PAHs诱导的炎症反应中可能起到关键作用。AhR被PAHs激活后，可能通过改变m6A修饰来影响基因表达。基于这一假设，我们提出，PM2.5携带的PAHs通过激活AhR，干扰m6A的正常调控，从而加速哮喘的进展。在之前的研究中，我们已经发现PM2.5能够通过METTL3和FTO改变m6A水平，进而影响基因表达和肺损伤。因此，本研究进一步探讨了PAHs对这些过程的影响。

### 研究方法与材料

本研究采用多种实验方法来验证PAHs对哮喘模型的影响。首先，通过使用特异性抗体，我们检测了FTO、NF-κB、ACKR3、GAPDH、α-SMA、纤维连接蛋白、前caspase1、p62、NLRP3、LC3B、胶原蛋白I、MUC5AC、METTL3、METTL14、IGF2BP1/2/3等蛋白的表达情况。所有抗体均来自Abcam和Cell Signaling Technology，用于Western blot和免疫荧光分析。

为了研究PAHs对哮喘模型的影响，我们建立了慢性哮喘模型，使用HDM（过敏原提取物）进行鼻内激发，并通过PAHs暴露评估其对肺部病理和功能的影响。实验中，将6-8周龄的C57BL/6J雌性小鼠分为不同的实验组，包括PBS对照组、PAHs组、哮喘组（HDM）以及哮喘+PAHs组（HDM+PAHs）。所有实验动物均在暴露前适应7天，并在暴露后进行肺功能测试和组织学分析。

此外，我们还使用了多种细胞实验方法，包括细胞活力检测（CCK-8）、免疫荧光染色、组织学分析（H&E、PAS、Masson三色染色、MUC5AC免疫组化）以及转录组分析（MeRIP-qPCR、m6A dot blot、RNA-seq）。这些方法有助于揭示PAHs对m6A修饰和基因表达的影响。

### 研究结果与分析

#### PAHs加剧哮喘模型中的炎症和肺纤维化

我们通过建立慢性哮喘模型，评估了PAHs对肺部病理和功能的影响。结果显示，PAHs显著加剧了哮喘小鼠模型中的炎症反应和肺纤维化。H&E染色显示，PAHs处理组的肺组织中出现了明显的炎症浸润，其中HDM+PAHs组的炎症评分最高。PAS和MUC5AC染色进一步证实了PAHs对杯状细胞增生和黏液分泌的增强作用。Masson三色染色显示，PAHs处理组的肺组织中胶原沉积明显增加，且在HDM+PAHs组中达到最大值。胶原蛋白I和α-SMA的表达也显著上调，表明PAHs促进了肺纤维化。支气管肺泡灌洗液（BALF）分析显示，PAHs处理组的总细胞数、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞数量显著增加，尤其是在HDM+PAHs组中更为明显。这些结果表明，PAHs能够与HDM协同作用，加剧哮喘的炎症反应、黏液过度分泌和肺纤维化。

#### FTO在PAHs诱导的气道重塑中的作用

FTO作为m6A的擦除酶，其表达水平与哮喘进展密切相关。我们的实验发现，PAHs处理显著降低了FTO的表达，尤其是在哮喘模型中。在体外实验中，我们发现PAHs处理的BEAS-2B细胞中，FTO的蛋白和mRNA水平均显著下降。通过过表达FTO，我们观察到其能够有效逆转PAHs对气道重塑的影响，包括NLRP3炎症小体的激活、胶原蛋白I和纤维连接蛋白的表达增加，以及MUC5AC的表达上调。这表明FTO在PAHs诱导的气道重塑中起着关键的负调控作用。

#### PAHs通过AhR抑制FTO表达

为了进一步探讨PAHs如何影响FTO的表达，我们进行了机制研究。结果表明，AhR信号通路在PAHs诱导的FTO抑制中起着核心作用。通过使用AhR抑制剂或基因敲除方法，我们发现AhR的抑制能够恢复FTO的表达和m6A水平，从而减少PAHs对气道炎症的影响。此外，ChIP-qPCR分析显示，AhR能够直接结合FTO启动子区域，而PAHs处理后这种结合显著减弱。这表明AhR通过调控FTO的转录，影响了m6A的水平和相关基因的表达。

#### ACKR3作为PAHs诱导的FTO下游靶标

通过整合m6A和RNA-seq数据，我们发现ACKR3是PAHs诱导的FTO下游靶标。在PAHs处理的BEAS-2B细胞中，ACKR3的mRNA和蛋白水平均显著增加，且其m6A修饰减少。FTO的敲除进一步增强了ACKR3的表达，而FTO的过表达则能够抑制其表达。此外，我们发现ACKR3的mRNA稳定性受到m6A修饰的影响，而IGF2BP1-3作为m6A阅读蛋白，能够结合ACKR3的mRNA，促进其稳定性。这表明ACKR3的表达受FTO和IGF2BP蛋白的共同调控。

#### FTO通过ACKR3调控自噬与炎症

自噬在肺部炎症和重塑中起着重要作用。我们的实验发现，PAHs处理能够显著增加自噬相关蛋白（如LC3B、ATG5、ATG7和p62）的表达。FTO的过表达能够抑制这些蛋白的表达，而FTO敲除的小鼠则表现出更强烈的自噬反应。通过进一步研究，我们发现ACKR3的表达能够驱动自噬相关基因的表达，包括ATG5、ATG7和p62。因此，FTO通过抑制ACKR3的表达，间接调控自噬水平，从而减轻肺部炎症和纤维化。

#### PAHs通过TNFα/NF-κB通路促进ACKR3表达

KEGG通路分析显示，PAHs处理显著富集了细胞因子-细胞因子受体信号通路，这可能解释了ACKR3的上调。同时，PAHs也增强了NF-κB和TNF信号通路的活性。通过qPCR和Western blot分析，我们发现PAHs处理的细胞中，TNF相关基因（如TNFRSF1A、TNFAIP3、NFKB2、RELA、RELB和NFKBIA）的表达显著增加。此外，TNFα处理能够抑制NF-κB的激活，并相应减少ACKR3和ATG5的表达，同时恢复FTO的表达。这些结果表明，PAHs通过激活TNFα/NF-κB通路，促进了ACKR3的表达，进而加剧了自噬和炎症反应。

### 讨论与展望

本研究揭示了PAHs通过激活AhR，抑制FTO的表达，从而导致m6A修饰的减少和ACKR3的稳定，最终促进自噬和炎症反应，加剧哮喘的进展。这一发现为理解PAHs在哮喘中的作用提供了新的分子机制，并提出了潜在的治疗靶点。FTO和ACKR3可能作为评估环境污染导致哮喘风险的生物标志物，而针对AhR-FTO-ACKR3通路的干预可能为哮喘治疗提供新的策略。

然而，本研究仍存在一些局限性。例如，缺乏直接的FTO与ACKR3 mRNA结合的实验证据，以及IGF2BP在体内的作用仍需进一步验证。此外，ACKR3如何具体激活自噬的机制仍需深入研究。未来的研究可以采用CLIP-seq等方法，直接验证FTO与ACKR3 mRNA的结合情况，并探索IGF2BP在体内的调控作用。同时，进一步评估FTO激活剂或ACKR3拮抗剂在预防或治疗PAHs诱导的哮喘中的疗效，将有助于开发新的干预策略。

### 环境与健康影响

PM2.5因其复杂的组成和微小的粒径，能够深入肺部，导致呼吸功能受损、感染增加、慢性炎症、肺纤维化甚至肺癌。其中，PAHs作为PM2.5的重要组成部分，因其致突变性和致癌性而备受关注。PAHs与哮喘、肺纤维化和COPD等肺部疾病密切相关。本研究发现，PAHs通过干扰FTO的表达，影响m6A修饰，进而促进ACKR3的表达和自噬反应，加剧哮喘的病理过程。这一发现不仅揭示了PAHs作为表观遗传危害的新机制，也为环境污染相关哮喘的治疗提供了新的方向。

综上所述，本研究通过系统性的实验方法，揭示了PAHs在哮喘中的作用机制，提出了AhR-FTO-ACKR3这一新的表观转录调控轴。这一机制的发现，不仅加深了我们对环境污染导致哮喘的分子理解，也为未来的治疗策略提供了理论依据。未来的研究应进一步探索这一通路的细节，并评估其在临床中的应用潜力。