非侵入性生物电疗法通过调控细胞代谢与炎症抑制视网膜新生血管形成

《Cell Communication and Signaling》：Non-invasive bioelectrical therapy suppresses retinal neovascularization by modulating cellular metabolism and inflammation

本研究针对抗VEGF疗法在治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病视网膜病变(DR)中的局限性，开发了经眼睑微电流刺激(TpES)这一非侵入性治疗新策略。研究人员通过激光诱导脉络膜新生血管(CNV)和链脲佐菌素(STZ)诱导的DR小鼠模型，结合原代小胶质细胞、人视网膜内皮细胞(HREC)及人RPE/脉络膜外植体实验，证实TpES可显著减少血管渗漏(~30%, p<0.001)和病灶面积，其作用机制是通过诱导线粒体去极化、降低ATP生成，进而耗竭内质网钙库，抑制促炎和促血管生成信号通路。该研究为AMD、DR等视网膜血管疾病提供了具有双重作用机制的新型治疗选择。

　　

在全球范围内，病理性视网膜新生血管是导致视力丧失的主要原因之一，尤其常见于年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病视网膜病变(DR)等疾病。据统计，AMD在2020年已影响1.96亿人，预计到2040年将升至2.88亿，其患病率在工业化国家与癌症相当。而DR作为糖尿病最常见的并发症，其患者中约半数即使接受抗VEGF治疗仍会进展为增殖性DR。目前，抗VEGF药物虽是CNV的标准疗法，但仅能改善40%患者的视力，且需反复眼内注射，长期阻断VEGF这一视网膜组成性表达蛋白也引发了对视网膜长期安全的担忧。

微胶质细胞激活和慢性神经炎症在疾病进展中扮演关键角色，通过促进血管通透性和血管生成，创造失衡的促血管生成微环境，包括增加白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和血管内皮生长因子(VEGF)的产生。因此，探索能同时靶向炎症和血管生成、且非侵入性的替代疗法迫在眉睫。非侵入性经眼睑电刺激(TpES)因其高临床转化潜力、安全性和非侵入性应用而备受关注，但其在眼部疾病中的治疗潜力和作用机制尚不明确。

为探究TpES的治疗效果，Lennikov等研究人员在《Cell Communication and Signaling》上发表了最新研究。他们每日对激光诱导的CNV和STZ诱导的DR小鼠模型施加微电流刺激(300μA, 20 Hz, 4分钟)，并通过荧光素血管造影、光学相干断层扫描(OCT)和免疫组织化学评估血管病理变化。机制研究利用原代小胶质细胞和HREC，评估TpES诱导的细胞内钙([Ca²⁺]_i)信号、线粒体膜电位和ATP产生的变化。此外，还培养了来自健康、AMD和DR供体的人RPE/脉络膜外植体，以评估TpES在健康和病理人组织中对血管生成的影响。

研究主要应用了激光诱导脉络膜新生血管(CNV)模型、链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病模型、经眼睑电刺激(TpES)技术、荧光素血管造影(FFA)和光学相干断层扫描(OCT)成像、原代小胶质细胞和人类视网膜内皮细胞(HREC)培养、细胞内钙离子([Ca²⁺]_i)成像（使用Fura-2 AM和BAPTA-1染料）、线粒体膜电位检测（JC-1染色）、高分辨率呼吸测量法（Seahorse分析）、蛋白质免疫印迹(Western Blot)、定量RT-PCR(qPCR)、细胞划痕实验、试管形成实验、人RPE/脉络膜外植体培养以及跨内皮电阻(TER)测量等关键技术方法。人组织样本来源于 Lions Gift of Sight 眼库提供的死后人供体眼睛。

TpES减轻激光诱导CNV中的小胶质细胞炎症反应和新生血管形成

研究发现，TpES显著降低了CNV模型中的血管渗漏（约30%，p<0.001）和病灶大小（p<0.05），同时抑制了小胶质细胞浸润和VEGF-A表达。通过免疫标记显示，TpES处理组的脉络膜新生血管面积、IBA1⁺和COX-2⁺细胞数量均显著减少。这些结果表明，非侵入性TpES能有效减小新生血管病灶大小，限制炎症细胞浸润，并降低VEGF-A表达。

TpES减少STZ诱导的糖尿病视网膜病变中的小胶质细胞激活和微动脉瘤形成

在DR模型中，TpES减轻了微动脉瘤的形成，并保留了内皮紧密连接。视网膜铺片免疫标记显示，TpES显著减少了糖尿病小鼠视网膜中微动脉瘤的数量（p<0.01），并改善了小胶质细胞的形态，使其突触长度显著长于假手术组。从糖尿病小鼠分离的原代小胶质细胞经ES处理后，COX-2阳性细胞比例和NF-κB p65核转位均显著降低，表明ES能抑制糖尿病条件下小胶质细胞的促炎激活。

ES通过抑制细胞内Ca²⁺反应抑制小胶质细胞激活

体外实验表明，ES处理抑制了原代小胶质细胞的迁移和增殖。ATP刺激能诱导小胶质细胞激活标记物Cox2、Il-1β、Il-6和Cd68的表达上调，并下调稳态标记物P2ry12，而ES预处理可减弱ATP诱导的这些变化。Fura-2测定显示，ES预处理显著减弱了ATP诱导的[Ca²⁺]_i激增。使用BAPTA-1染料的实时成像显示，ES在无胞外Ca²⁺条件下可引起[Ca²⁺]_i缓慢释放，表明ES诱导了细胞内钙库的耗竭。IP3R抑制剂2-APB预处理可消除ES的作用，恢复ATP刺激后的[Ca²⁺]_i反应，提示ES通过IP3R介导的机制耗竭内质网钙库。

ES诱导线粒体去极化并限制小胶质细胞的能量代谢

JC-1染色显示ES引起线粒体膜电位降低，与解偶联剂FCCP效果类似。Seahorse线粒体压力测试表明，ES降低了小胶质细胞的基线呼吸和最大呼吸速率，但不影响质子漏。ATP生物发光法证实ES处理后细胞内总ATP含量显著降低。这些结果表明ES诱导线粒体去极化并减少ATP产生，这可能导致细胞内钙库的Ca²⁺摄取功能受损或耗竭。

ES通过调节细胞内Ca²⁺信号抑制内皮细胞的迁移和血管生成反应

ES处理显著抑制了HREC的迁移、增殖和试管形成能力。免疫印迹和免疫标记显示ES降低了HREC中VEGF-A的表达。与小胶质细胞类似，ES也降低了HREC的线粒体膜电位和ATP诱导的[Ca²⁺]_i激增，并减少了ATP产生。SERCA泵抑制剂毒胡萝卜素(thapsigargin)处理模拟了ES的效果，均能抑制ATP诱导的[Ca²⁺]_i反应和试管形成，且不增加细胞毒性，表明耗竭ER钙库是ES抑制血管生成的关键机制。

ES减弱人RPE/脉络膜外植体中的血管生成反应

在来自健康供体的人RPE/脉络膜外植体中，ES处理显著减少了血管出芽面积。更重要的是，来自nAMD和DR供体的外植体在体外培养中保留了病理性的促血管生成表型，其血管出芽显著增加，而ES处理能有效抑制这种病理性的血管生成。在人类微胶质细胞系HMC-3与RPE/脉络膜外植体的共培养实验中，ATP激活的HMC-3细胞条件培养基能增加HREC的单层通透性，破坏紧密连接蛋白ZO-1和VE-钙粘蛋白的表达；而经ES预处理的HMC-3细胞条件培养基则能保持内皮屏障功能。跨内皮电阻(TER)测量进一步证实ES处理不会破坏已形成的HREC单层屏障的完整性。

研究结论与意义

本研究确立了TpES作为一种双重作用疗法，通过调节小胶质细胞和内皮细胞的代谢，同时减轻炎症和病理性血管生成。其核心机制在于ES诱导线粒体去极化，降低ATP生产，进而削弱肌浆网/内质网Ca²⁺-ATP酶(SERCA)功能，耗竭内质网钙库，最终限制细胞在外部刺激下产生Ca²⁺激增的能力，从而抑制促炎和促血管生成反应。

该研究首次在来自nAMD和DR供体的人眼组织中证实病理性的促血管生成表型可在体外保留，并证明ES能有效抑制此过程，为临床前发现与临床转化搭建了桥梁。鉴于其非侵入性、靶向视网膜病理关键通路的能力，以及之前报道的对视网膜神经节细胞和光感受器的神经保护作用，TpES代表了一种极具前景的治疗策略，不仅适用于AMD和DR，也可能惠及其他视网膜血管疾病患者，为目前抗VEGF疗法疗效有限或面临长期安全顾虑的患者提供了新的希望。