hTERT永生化胎盘间充质基质细胞源细胞外囊泡的稳定生产：整合货物分析与功能验证为肺纤维化治疗提供新策略

《Stem Cell Research & Therapy》：Stable production of immortalized hPC-MSC-derived extracellular vesicles: integrated cargo analysis and functional validation

本研究针对细胞外囊泡(EVs)大规模临床应用面临的供体异质性、批次差异和高成本等挑战，通过hTERT基因永生化人胎盘绒毛膜间充质基质细胞(hPC-MSCs)，建立了稳定可靠的EVs生产平台。研究发现永生化细胞分泌的EVs在粒径分布、蛋白标记物和功能特性方面与亲代细胞高度相似，并在博来霉素(BLM)诱导的肺纤维化(PF)大鼠模型中展现出与地塞米松(DXM)和吡非尼酮(PFD)相当的抗纤维化疗效。该工作为EVs的可持续规模化生产及肺纤维化治疗提供了新的理论依据和解决方案。

　　

在再生医学领域，细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)作为细胞间通讯的关键介质，正展现出巨大的疾病治疗潜力。这些纳米级囊泡携带蛋白质、脂质、microRNA等生物活性分子，能够继承亲代细胞的治疗特性，同时规避细胞治疗可能带来的致瘤性和感染风险。然而，EVs的临床转化面临严峻挑战：原代细胞培养存在供体异质性、批次间差异大、细胞寿命有限等问题，导致EVs产量不稳定、成分不一致，严重制约其规模化应用。

针对这一瓶颈，同济大学附属肺科医院等机构的研究团队在《Stem Cell Research & Therapy》发表创新性研究，通过建立hTERT基因永生化的胎盘绒毛膜间充质基质细胞(immortalized Placental Chorionic Mesenchymal Stromal Cells, iPC-MSCs)平台，实现了EVs的稳定生产。研究人员系统评估了永生化对EVs特性的影响，并深入验证其在肺纤维化治疗中的应用价值。

关键技术方法

研究采用慢病毒载体将hTERT基因导入原代hPC-MSCs构建永生化细胞系，通过转录组测序(RNA-seq)、流式细胞术、染色体核型分析等技术全面表征细胞特性。使用聚乙二醇(PEG)沉淀法分离EVs，借助透射电镜(TEM)、纳米颗粒追踪分析(NTA)、单粒子干涉反射成像(SP-IRIS)进行形态学和质量控制。采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行蛋白质组学分析，并建立博来霉素(BLM)诱导的大鼠肺纤维化模型，通过组织病理学染色、羟脯氨酸含量测定等评估治疗效果。

研究结果

成功构建具有延长寿命的永生化胎盘绒毛膜间充质基质细胞(iPC-MSCs)

研究人员利用pLV-IRES-hygro骨架成功构建了过表达hTERT基因的慢病毒质粒，通过二代慢病毒三质粒系统建立了hTERT基因永生化iPC-MSC细胞系。实验显示，原代PC-MSCs培养至第10代时出现衰老迹象，而iPC-MSCs可稳定增殖至第60代仍保持正常形态。RT-PCR验证证实iPC-MSCs中hTERT基因高效表达，而亲代细胞中几乎无表达。

iPC-MSCs中细胞表面标记谱未改变

流式细胞术分析显示，第60代iPC-MSCs与第3代亲代细胞均高表达CD73、CD105、CD29、CD90等阳性标记物(＞99%)，而CD34、CD45等阴性标记物表达低于1%，表明永生化过程未改变细胞表面表型。

iPC-MSCs在连续体外传代过程中保持基因组稳定性

核型分析结果表明，即使传代至第60代，iPC-MSCs仍保持正常的二倍体核型(46, XY)，未检测到染色体畸变，证实了该细胞系在长期培养中的遗传稳定性。

两种细胞系呈现高度相似的基因表达谱

RNA测序分析鉴定出5165个差异表达基因(DEGs)，其中2270个上调，2895个下调。GO和KEGG富集分析显示这些基因主要富集在炎症反应、胶原纤维组织等生物过程，以及p53、TGF-β、PI3K-AKT等纤维化相关信号通路。

hTERT基因插入不改变细胞外囊泡的特性

EVs表征结果显示，永生化细胞分泌的EVs与亲代细胞来源的EVs均呈现典型的杯状形态，粒径分布符合EVs标准范围(30-150nm)，且CD63、CD81、CD9等表面标记物表达相似，表明永生化过程未显著影响EVs的表型和分泌效率。

iPC-MSCs来源EVs的综合蛋白质组学分析

蛋白质组学鉴定出1982种蛋白质和16005条肽段，尽管两种来源EVs的蛋白质组高度重叠，但永生化细胞来源EVs中检测到445个差异表达蛋白(DEPs)，其中108个上调，337个下调。这些差异蛋白主要富集在核糖体生物发生、翻译调控、胶原纤维组织等过程，且与ECM-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路等密切相关。

iPC-MSCs来源的EVs在大鼠中显著减轻肺纤维化

动物实验表明，iPC-MSC-EVs治疗能显著改善BLM诱导的肺纤维化。组织病理学显示，中、高剂量EVs组(5×10⁷和5×10⁸颗粒/剂量)肺泡结构更致密，肺损伤面积减少；Masson染色显示胶原纤维沉积显著降低(51.6%-60.5%)；羟脯氨酸含量测定进一步证实EVs治疗能有效减少胶原沉积。值得注意的是，EVs的抗纤维化效果与阳性药物DXM和PFD相当。

研究结论与意义

该研究首次系统阐述了hTERT介导的永生化对PC-MSCs来源EVs的影响，证实永生化细胞可作为高质量、均一化的EVs生产来源。iPC-MSCs在延长细胞寿命的同时，保持了正常的表型特征、分化潜能和遗传稳定性，其分泌的EVs在物理特性和功能活性方面与亲代细胞高度一致。蛋白质组学分析揭示了永生化过程对EVs货物组成的特异性调节，特别是与细胞外基质组织和免疫调节相关的蛋白表达变化。

在肺纤维化治疗应用中，iPC-MSC-EVs展现出剂量依赖性的抗纤维化效应，通过调节胶原沉积、减轻炎症反应有效改善肺功能。该研究不仅为EVs的规模化生产提供了可靠的技术平台，也为肺纤维化的细胞无治疗策略开辟了新途径。永生化细胞系的建立克服了原代细胞培养的批次差异和寿命限制问题，为再生医学领域的临床转化提供了重要技术支撑。未来研究可进一步探索EVs中特定功能分子的作用机制，优化给药方案，推动其向临床应用迈进。