多维度条件下猪胚胎干细胞向中脑多巴胺能神经元的体外高效分化及功能验证

《Stem Cell Research & Therapy》：In vitro derivation of midbrain dopaminergic neurons from porcine embryonic stem cells in multi-dimensional conditions

本研究针对猪多能干细胞向中脑多巴胺能神经元分化效率低的问题，开发了物种优化的2D和3D分化方案。研究人员发现猪细胞需要更高SHH和GSK3抑制阈值才能有效诱导FOXA2+腹侧中脑祖细胞，且IVF来源的pESCs比PA来源细胞表现出更强的多巴胺能分化能力。通过单细胞测序揭示了猪特异性mDA谱系轨迹，建立的猪中脑类器官(pMLOs)在28天即出现功能成熟神经元，为大型动物神经发育模型提供了新平台。

　　

在神经科学和再生医学领域，帕金森病(Parkinson's disease, PD)作为常见的神经退行性疾病，其病理特征是中脑黑质区多巴胺能神经元选择性丢失。传统研究多采用啮齿类动物模型，但在脑结构复杂性和发育时序上与人类存在显著差异。猪因其 gyrencephalic 脑结构、产后脑发育模式与人类相似，且中脑黑质解剖结构更接近人类，成为理想的 large-animal 模型。然而，猪胚胎干细胞向功能性中脑多巴胺能神经元的高效分化体系尚未建立，3D类器官技术在大动物模型中的应用更是空白。

针对这一瓶颈，Choi等研究人员在《Stem Cell Research & Therapy》发表了创新性研究。他们通过系统优化信号通路激活策略，首次建立了从猪胚胎干细胞体外高效分化功能性mDA神经元的标准化方案，并成功构建了具有成熟电生理特性和多巴胺释放能力的猪中脑类器官。

研究采用的关键技术方法包括：通过双SMAD抑制联合SHH、CHIR99021、FGF8的阶梯式诱导策略进行神经分化；利用免疫荧光、膜片钳电生理、微电极阵列记录等功能验证手段；结合RNA测序和单细胞RNA测序技术解析分化轨迹；采用超低吸附板进行3D类器官培养。实验使用来自体外受精和孤雌生殖激活的猪胚胎干细胞系进行对比研究。

发育中脑多巴胺能神经元的最佳诱导方案

研究人员发现猪细胞需要1.5μM CHIR99021才能有效诱导中脑命运，高于人类细胞所需浓度。500ng/ml SHH可显著提高FOXA2⁺细胞比例至11.3%，而层粘连蛋白替代Matrigel并未改善腹侧中脑祖细胞诱导效率。

猪VM祖细胞向mDA神经元的终末分化

IVF来源的pESCs在分化第28天表现出更高的TH阳性细胞比例，表达LMX1A、FOXA2、EN1等关键标志物。至第45天，细胞表达A9型mDA神经元标志物GIRK2，而不表达A10型标志物CALB。

猪mDA神经元的功能特性

膜片钳记录显示分化30天的细胞具有成熟电生理特性，IVF细胞动作电位发放频率(4-6Hz)更接近天然mDA神经元。多巴胺释放实验证实KCl刺激可诱发显著分泌反应，3D类器官的反应强度优于2D培养。

分化细胞的转录组特征

Bulk RNA测序显示基因表达呈现时序性变化：第16天富集神经发生相关基因，第28天转向突触功能基因，第45天出现血管柔脑膜细胞相关基因。IVF细胞在所有时间点均表现出更强的mDA相关基因表达。

猪中脑类器官的生成与表征

pMLOs在第5天即形成表达ZO-1、NESTIN的神经上皮结构。MEA记录显示随培养时间延长，电极活性、发放频率和网络爆发活动显著增加，表明神经元功能成熟。

单细胞转录组揭示pMLOs动态变化

scRNA-seq成功捕获103,310个高质量细胞，发现多巴胺能神经元集群最早于第11天出现，表达LMX1A、PLXDC2等特征基因。随时间推移，神经元和胶质细胞比例逐渐增加，呈现连续分化轨迹。

该研究首次系统阐明了猪干细胞向mDA神经元分化的物种特异性信号要求，揭示了IVF来源细胞在分化效率上的优势。建立的pMLOs平台不仅加速了神经元功能成熟（28天vs人类35天以上），还通过单细胞分辨率揭示了猪特异性发育轨迹。这一模型为研究大型动物神经发育提供了可扩展的体外系统，对帕金森病机制研究和药物筛选具有重要意义，同时为干细胞治疗提供了新的大动物模型选择。