基于T细胞耗竭与线粒体功能障碍相关基因的乳腺癌预后模型构建与验证

《Clinical and Experimental Medicine》：Exploring the prognostic value of T cell exhaustion and mitochondrial dysfunction related genes in breast cancer through bioinformatics analysis and RT-qPCR validation

本研究针对乳腺癌异质性高、预后评估困难等临床挑战，通过生物信息学分析结合实验验证，系统探讨了T细胞耗竭(TEX)和线粒体功能障碍(MD)相关基因的预后价值。研究人员整合TCGA和GEO数据库的转录组数据，筛选出7个关键预后基因(BCL2A1、GZMB、IRF7、MTHFD2、TFRC、JUN、PPP1R15A)，构建了能够有效预测患者生存的风险模型。单细胞测序揭示MIF-(CD74+CD44)轴在细胞间通讯中的关键作用，RT-qPCR实验验证了基因表达差异。该研究为乳腺癌免疫治疗反应预测提供了新的生物标志物，为开发靶向线粒体-免疫轴的治疗策略奠定理论基础。

　　

乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤，每年新增病例约230万例，占所有女性癌症的24.5%，仍是癌症相关死亡的主要原因之一。这种疾病表现出显著的分子多样性，主要亚型包括激素受体阳性、HER2富集和三阴性乳腺癌，每种亚型都具有独特的病理特征，如基因组不稳定性、肿瘤微环境重塑和代谢重编程。当前的治疗方式包括手术、放疗、内分泌治疗和靶向药物，但仍面临巨大挑战，如耐药性（特别是ER+癌症中的ESR1突变）和对三阴性乳腺癌的有限疗效。诊断挑战由于依赖组织活检等侵入性程序和昂贵的基因检测而持续存在，而常规成像方法无法检测20-30%的早期病例。

在这一背景下，T细胞耗竭和线粒体功能障碍作为影响肿瘤免疫应答和代谢重编程的两个关键因素，逐渐成为研究热点。T细胞耗竭是T淋巴细胞的一种功能失调状态，以效应功能逐渐丧失、抑制性受体持续表达和表观遗传/代谢重编程为特征。在乳腺癌中，恶性细胞通过肿瘤来源的细胞外囊泡促进CD8+ T细胞耗竭，创造了一个与疾病晚期和不良预后相关的免疫抑制微环境。与此同时，线粒体功能障碍在乳腺癌发病机制中至关重要，异常情况如线粒体动力学受损、氧化应激增加和生物发生缺陷经常发生。线粒体DNA突变等因素改变代谢途径，导致细胞抗凋和治疗耐药。然而，T细胞耗竭相关基因和线粒体相关基因在乳腺癌中的相互作用机制仍不清楚。

为了解决这些问题，研究人员开展了一项整合生物信息学分析和实验验证的研究，旨在识别与T细胞耗竭和线粒体功能障碍相关的乳腺癌预后基因，并构建可靠的预后模型。

本研究主要采用了多组学数据整合分析策略，利用TCGA-BRCA队列（1084个肿瘤样本和112个正常样本）作为训练集，GEO数据库的GSE88770数据集（117个肿瘤样本）作为验证集。通过差异表达分析筛选差异表达基因，并与683个T细胞耗竭相关基因和2030个线粒体相关基因取交集，获得候选基因。采用单变量Cox回归和LASSO回归筛选预后基因，构建风险评分模型。通过基因集富集分析、免疫浸润评估（ssGSEA和CIBERSORTx）、肿瘤微环境分析（ESTIMATE算法）和药物敏感性预测（pRRophetic包）等多维度验证模型效能。同时整合单细胞RNA测序数据（GSE161529和GSE243526数据集）解析细胞异质性和细胞间通讯，并通过RT-qPCR实验验证关键基因表达。

识别BRCA中的DEGs候选基因

研究人员首先在训练集中识别肿瘤和正常样本之间的差异表达基因，共发现5041个DEGs（p<0.05，|log₂FC|>1），包括3047个上调基因和1967个下调基因。通过将DEGs与TEXRGs和MRGs取交集，最终确定了33个候选基因，这些基因在后续分析中作为研究T细胞耗竭和线粒体功能障碍在乳腺癌中作用的基础。

候选基因的富集分析和PPI网络构建

对33个候选基因进行GO和KEGG富集分析，发现它们显著富集于病毒过程、线粒体外膜、核受体活性等生物过程，以及人类T细胞白血病病毒1感染、麻疹、甲型流感等通路。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析揭示了31个相互作用基因和94个相互作用对，如IL6与JUN、ACE2和PPARA的相互作用，表明这些基因在乳腺癌中可能通过复杂的网络调控发挥作用。

预后基因筛选与模型构建

通过单变量Cox回归分析筛选出12个候选预后基因（p<0.2），随后进行LASSO回归分析，最终确定了7个预后基因：MTHFD2、TFRC、JUN、IRF7、PPP1R15A、GZMB和BCL2A1。基于这些基因的表达水平和回归系数，构建了风险评分模型：风险评分 = (0.227×MTHFD2) + (0.018×TFRC) - (0.07×JUN) - (0.03×IRF7) - (0.01×PPP1R15A) - (0.05×GZMB) - (0.147×BCL2A1)。

预后模型验证与独立预后分析

根据风险评分的最佳截断值（-0.176），将训练集样本分为高风险组（575例）和低风险组（509例）。Kaplan-Meier生存分析显示两组间生存率存在显著差异（p<0.0001），高风险组生存率更低。ROC曲线分析显示3年、5年和7年生存率的AUC值分别为0.64、0.61和0.69，表明模型具有良好的预测准确性。在验证集中，模型同样表现出良好的预测性能，高风险组和低风险组的生存率存在显著差异（p=0.036）。

多变量Cox分析显示风险评分、年龄、N分期和M分期是乳腺癌的独立预后因素（p<0.05）。基于这些因素构建的列线图模型在预测3年、5年和7年生存率方面表现出良好的校准度和临床实用性。

高风险组与低风险组的GSEA分析

基因集富集分析揭示了39个显著失调的通路（|NES|>1，p<0.05）。高风险组中，细胞周期、卵母细胞减数分裂和移植物排斥等通路显著富集；而低风险组中，糖基磷脂酰肌醇锚定生物合成等通路富集。这些结果表明不同风险组在生物学通路激活模式上存在显著差异，为理解预后基因的功能提供了重要线索。

BRCA的免疫景观分析

免疫浸润分析显示，高风险组和低风险组在28种免疫细胞类型的浸润水平上存在显著差异。高风险组表现出免疫抑制特征，包括1型T辅助细胞（cor=-0.68，p<0.0001）等多种免疫细胞浸润减少。ESTIMATE分析进一步证实高风险组的免疫评分（p<2.2×10^-16）和基质评分（p<2.2×10^-16）显著降低，表明肿瘤微环境中免疫和基质成分减少。

药物敏感性和TMB分析

药物敏感性分析显示，120种化疗和靶向药物的IC₅₀值与风险评分呈正相关（|cor|>0.3，p<0.05）。其中AZ628（cor=0.60）、CI.1040（cor=0.63）和roscovitine（cor=0.62）与风险评分相关性最高。肿瘤突变负荷分析显示，高风险组和低风险组在驱动基因突变模式上存在差异，但TMB评分无显著差异。

单细胞转录组分析

单细胞RNA测序分析揭示了乳腺癌肿瘤生态系统的细胞组成和相互作用。在GSE161529数据集中，69，417个细胞被注释为6种细胞类型：上皮细胞（28，962个）、组织干细胞（25，614个）、内皮细胞（11，604个）、T细胞（1，824个）、巨噬细胞（1，184个）和B细胞（229个）。细胞间通讯分析显示上皮细胞-巨噬细胞串扰是主要的相互作用轴，MIF-（CD74+CD44）配体-受体对在细胞间通讯中起关键作用。

T细胞亚群分析和轨迹分析

对T细胞进行亚群分析，识别出8个亚型。伪时间轨迹分析揭示了9个不同的分化状态，预后基因在T细胞分化过程中表现出动态表达模式。JUN、MTHFD2和PPP1R15A随着伪时间进展表达逐渐降低，而GZMB表达先升高后降低，这些动态变化为了解T细胞功能状态提供了重要线索。

预后基因的表达验证

通过RT-qPCR实验验证了7个预后基因在临床样本中的表达。结果显示MTHFD2、TFRC、IRF7和BCL2A1在肿瘤组织中显著上调（p<0.05），而JUN显著下调，与生物信息学分析结果一致，证实了研究结果的可靠性。

本研究通过整合多组学数据和实验验证，系统阐述了T细胞耗竭和线粒体功能障碍相关基因在乳腺癌预后评估中的重要价值。研究发现的风险模型不仅能够有效预测患者生存，还揭示了肿瘤微环境中免疫代谢交互作用的新机制。特别值得注意的是，单细胞分析发现的MIF-（CD74+CD44）信号轴和T细胞分化过程中预后基因的动态表达模式，为了解乳腺癌免疫逃逸机制提供了新的视角。

从临床转化角度，这项研究具有多重意义：首先，七基因特征为乳腺癌预后评估提供了新的生物标志物组合，有望改善现有临床预后评估体系的不足；其次，研究揭示的线粒体-免疫轴机制为开发靶向肿瘤代谢的免疫治疗策略提供了理论依据；最后，研究建立的综合分析框架可推广至其他肿瘤类型的研究中，具有重要的方法论价值。

然而，研究仍存在一些局限性，如药物敏感性预测的临床转化价值需要进一步验证，风险模型的预测精度有待提高，样本量尤其是实验验证部分相对有限等。未来研究需要通过扩大样本量、开展功能性实验和临床转化研究，进一步验证这些发现的临床应用价值。

总的来说，这项研究通过创新性地整合T细胞耗竭和线粒体功能障碍两个关键生物学过程，建立了可靠的乳腺癌预后模型，深化了对肿瘤微环境免疫代谢相互作用的理解，为乳腺癌精准治疗提供了新的思路和靶点。研究成果发表在《Clinical and Experimental Medicine》杂志，为乳腺癌研究领域做出了重要贡献。