基于ceRNA网络整合生物信息学解码揭示MASLD新型治疗靶点

《Clinical and Experimental Medicine》：Integrated bioinformatics decoding of the MASLD ceRNA network reveals novel therapeutic targets

本研究针对代谢功能障碍相关脂肪性肝病(MASLD)发病机制不清的问题，通过整合生物信息学方法构建ceRNA调控网络，发现IL1β、TLR2和TLR4等关键基因及hsa-miR-21-5p-TLR2/hsa-miR-34a-IL1B通路在MASLD中发挥核心作用，为早期诊断和治疗提供了新靶点。

　　

随着全球肥胖人群的快速增长，代谢功能障碍相关脂肪性肝病(MASLD)已成为最常见的慢性肝病，影响超过10亿人口。这种疾病谱从单纯性脂肪变性进展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌，给全球公共卫生系统带来沉重负担。然而，MASLD的分子机制尚未完全阐明，特别是代谢紊乱与慢性低度炎症之间的相互作用机制仍不明确，这严重制约了早期诊断和有效治疗策略的开发。

在这项发表于《Clinical and Experimental Medicine》的研究中，余世安、江新华和彭龙等研究人员采用整合生物信息学方法，对MASLD的ceRNA调控网络进行系统性解码。研究团队从GEO数据库下载了GSE205645、GSE49541和GSE63067三个微阵列数据集，通过差异表达分析识别出326个差异表达基因(DEGs)，其中232个上调，94个下调。

功能富集分析揭示了MASLD相关的关键生物学通路。基因集富集分析(GSEA)显示，白细胞介素10信号(ES=0.837)、中性粒细胞脱颗粒(ES=0.596)以及白细胞介素4和13信号(ES=0.644)等炎症相关通路显著富集。KEGG通路分析表明，细胞周期、细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞衰老、PPAR信号通路和p53信号通路在MASLD发病中起重要作用。

研究人员构建了包含100个节点和1920个边的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，并利用MCODE算法识别出三个重要模块。通过四种算法(最大聚类中心性、边缘渗透组分、最大邻域成分和度中心性)的交集分析，确定了七个枢纽基因：IL1β、CCL2、TLR2、TLR4、ITGAM、CXCL8和ICAM1。

验证分析显示，IL1β、TLR2、TLR4、CCL2和ICAM1在MASLD患者肝组织中表达显著上调，且具有较高的诊断价值。受试者工作特征(ROC)曲线分析表明，ICAM1和IL1β的曲线下面积(AUC)均为1.000，TLR2为0.979，CCL2为0.829，TLR4为0.667。

研究团队进一步构建了ceRNA调控网络，发现hsa-miR-21-5p-TLR2和hsa-miR-34a-IL1β通路可能是MASLD发病的关键调控轴。该网络包含30个circRNA、114个lncRNA和2个miRNA之间的复杂相互作用。

为验证生物信息学发现，研究人员进行了动物实验。C57BL/6雄性小鼠被随机分为正常饮食组和高脂饮食组，喂养10-12周后采集肝组织样本。苏木精-伊红(H&E)染色显示MASLD组出现明显脂肪积累和免疫细胞浸润。

实时定量PCR(RT-PCR)、蛋白质印迹(Western Blot)和多重免疫荧光(mIHC)结果一致证实，与正常肝组织相比，MASLD肝组织中IL-1β、TLR2和TLR4的表达水平显著升高。这些实验验证了生物信息学分析结果的可靠性。

本研究采用的主要技术方法包括：从GEO数据库获取MASLD相关基因表达数据集进行差异表达分析；利用STRING数据库构建PPI网络并识别关键模块；通过多种算法筛选枢纽基因；使用Starbase数据库预测ceRNA相互作用；建立高脂饮食诱导的MASLD小鼠模型进行实验验证。

质量保证和DEGs特征描述

研究人员通过数据标准化处理，使各样本数据中位数基本平行。主成分分析(PCA)和均匀流形近似和投影(UMAP)显示MASLD样本与对照样本之间存在良好区分。从GSE63067数据集共识别出326个DEGs，包括232个上调和94个下调基因。

功能特征分析

GSEA分析显示，MASLD样本中最显著的基因集与白细胞介素4、10、13信号以及中性粒细胞脱颗粒相关。KEGG通路分析发现细胞周期、细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞衰老等通路显著富集。

PPI网络构建和模块分析

构建的复杂PPI网络包含100个节点和1920个边。模块1得分最高(11分，含55个节点和1558个边)，模块2得分5.0(5个节点和9个边)，模块3得分4.588(18个节点和39个边)。

关键基因预测和目标miRNA

通过四种算法筛选出七个交叉基因：IL1β、CCL2、TLR2、TLR4、ITGAM、CXCL8和ICAM1。随后预测了这7个枢纽基因的24个目标miRNA，构建了包含29个RNA-miRNA对的共表达网络。

枢纽基因验证和ROC曲线

使用验证数据集深入研究了枢纽基因的mRNA含量，结果显示四个枢纽基因在MASLD中表达上调。ROC曲线分析表明ICAM1和IL1β具有最高的AUC值(1.000)，ITGAM为0.991，TLR2为0.979，CCL2为0.829，TLR4为0.667。

ceRNA网络构建

基于预测的目标miRNA、lncRNA和circRNA，使用Cytoscape软件可视化ceRNA网络。选择特定的下调miRNA和上调lncRNA进行详细分析，发现hsa-miR-21-5p和hsa-miR-34a-5p在MASLD患者中下调。

关键基因表达和诊断效力的实验验证

通过RT-PCR、免疫组织化学、H&E染色、多重免疫荧光和Western Blot评估关键基因的表达模式和诊断效力。动物实验显示MASLD组出现显著脂肪积累，IL1β、TLR2和TLR4蛋白表达和IHC评分均高于正常肝组织。

研究讨论部分指出，MASLD是全球最普遍的与肥胖相关的慢性肝病，影响20-30%的全球成年人。其严重程度从单纯性脂肪变性到NASH不等，后者与肝脂肪变性、肝细胞膨胀、炎症和组织纤维化相关。虽然已有大量研究，但对MASLD发病机制的全面理解仍不完整。

本研究的创新点在于首次通过整合多组学数据构建了MASLD的ceRNA调控网络，揭示了hsa-miR-21-5p-TLR2和hsa-miR-34a-IL1β通路在疾病发生中的核心作用。IL-1β作为一种重要的促炎细胞因子，通过与Toll样受体(TLR)信号协同作用，促进MASLD的发展。TLR2和TLR4作为先天免疫的关键调节因子，在肝脏炎症和纤维化过程中发挥重要作用。

然而，本研究也存在一定局限性。首先，这是一项回顾性研究，可能需要更大样本量的体内实验来支持观察结果。其次，枢纽基因的确切功能和涉及的分子机制需要在未来研究中进一步验证，才能安全有效地应用于临床实践。

总之，这项研究为MASLD的发病机制提供了有力证据。枢纽基因与免疫标志物显著相关，可能作为MASLD的潜在诊断和治疗靶点。大多数枢纽基因在MASLD患者和正常对照之间表现出显著差异表达。IL1β、TLR2、TLR4、CCL2和ICAM1可能在疾病进展中起关键作用，可作为诊断标志物和治疗靶点。这些发现有望增进对疾病的理解并指导其治疗。