rs604702通过调控PCAT18/miR-759/SPRR3轴影响乳腺癌风险的机制研究

《Hormones & Cancer》：rs604702 confers breast cancer risk by influencing PCAT18/miR-759/SPRR3 axis

本研究针对GWAS鉴定的乳腺癌风险位点rs527616，通过连锁不平衡分析发现rs604702为潜在致病SNP。研究人员证实rs604702通过改变BARX2转录因子结合活性，调控增强子与PCAT18启动子的空间互作，进而通过miR-759/SPRR3通路影响乳腺癌细胞增殖、迁移等恶性表型。该发现为乳腺癌遗传易感性机制提供了新视角。

　　

乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤，其发生发展具有明显的遗传易感性。近年来全基因组关联研究（GWAS）发现染色体18q11区域的rs527616位点与乳腺癌风险显著相关，但由于GWAS芯片覆盖限制，该位点是否为首要致病突变仍存争议。更关键的是，该区域毗邻的长链非编码RNA基因AQP4-AS1虽被推测为潜在靶基因，但其在乳腺癌中的表达情况及功能机制始终未被验证。

为破解这一谜团，张欣欣团队通过分析千人基因组计划数据，发现rs604702等4个SNP与rs527616存在高度连锁不平衡。随后通过双荧光素酶报告基因实验率先证实，rs604702的G等位基因能显著增强转录活性（P=2.6×10^-6），而其他SNP等位基因无此功能差异，提示rs604702才是真正的功能性变异。

在机制探索中，研究人员发现rs604702位于活跃增强子区域，其G等位基因能显著增强BARX2转录因子的结合亲和力。通过染色质构象捕获技术（3C）进一步揭示，该增强子可与PCAT18（前列腺癌相关转录本18）启动子发生空间互作，而与邻近的蛋白编码基因KCTD1和AQP4无相互作用。值得注意的是，曾被推测为靶基因的AQP4-AS1在乳腺癌细胞系MCF-7中几乎不表达，而PCAT18在乳腺癌组织中表达显著上调（P=0.019），且主要定位于细胞核。

功能实验表明，稳定敲低PCAT18可使乳腺癌细胞增殖、迁移、伤口愈合和集落形成能力显著下降，同时伴随SPRR3（小脯氨酸丰富蛋白3）表达降低。进一步研究发现，转染miR-759抑制剂可逆转PCAT18敲低引起的表型变化，证实PCAT18通过吸附miR-759解除其对SPRR3的抑制作用。最后利用CRISPR/Cas9技术敲除rs604702周边增强子区域，成功再现了PCAT18/SPRR3表达下调及癌细胞恶性表型抑制现象。

关键技术方法包括：基于千人基因组计划的连锁不平衡分析、双荧光素酶报告基因检测、染色质免疫共沉淀（ChIP）、凝胶迁移实验（EMSA）、染色质构象捕获（3C）、RNA-seq数据分析（来源：SRA数据库SRP068551）、慢病毒介导的基因敲低/过表达、CRISPR/Cas9基因编辑等。

3.1 Genetic variations nearby rs527616

通过分析三大人群基因组数据，发现rs604702等4个SNP与GWAS标志位点rs527616存在高度连锁不平衡（r²>0.8），提示它们可能是乳腺癌的潜在致病突变。

3.2 Function of these five SNPs

双荧光素酶报告基因实验显示，仅rs604702的G等位基因能显著增强转录活性（约2.5倍，P=2.6×10^-6），而其他SNP等位基因无功能差异，证明rs604702是关键功能性SNP。

3.3 Interaction between rs604702 and TF

ChIP和EMSA实验证实BARX2转录因子可特异性结合rs604702区域，且G等位基因结合亲和力更高，揭示该SNP通过影响转录因子结合调控基因表达。

3.4 Spatial interaction between the enhancer containing rs604702 and nearby genes

3C实验发现含rs604702的增强子与PCAT18启动子存在空间互作，而与AQP4-AS1互作强度较低，结合表达谱数据最终确定PCAT18为真实靶基因。

3.5 AQP4-AS1 and PCAT18 expression in breast tissue

RT-PCR和RNA-seq分析表明AQP4-AS1在乳腺癌组织中几乎不表达，而PCAT18在癌组织中显著高表达且主要定位于细胞核，支持其作为癌基因的功能。

3.6 Effect of PCAT18 on cell phenotype

稳定敲低PCAT18可显著抑制乳腺癌细胞增殖、迁移、伤口愈合和集落形成能力（P<0.01），证实PCAT18是乳腺癌的促癌基因。

3.7 Effect of miR-759 on gene expression and cell phenotype

转染miR-759抑制剂可逆转PCAT18敲低引起的SPRR3表达下降和细胞表型抑制（P<0.05），验证PCAT18通过miR-759/SPRR3轴发挥作用。

3.8 Effect of enhancer knock-out

CRISPR/Cas9敲除增强子区域后，PCAT18和SPRR3表达显著下调（P<0.05），癌细胞恶性表型受到抑制，最终证实rs604702通过增强子活性调控乳腺癌发生。

本研究首次揭示rs604702而非rs527616是乳腺癌风险位点的关键功能性SNP，并阐明其通过BARX2-PCAT18-miR-759-SPRR3信号轴调控乳腺癌发展的新机制。该发现不仅纠正了既往关于该位点致病机制的误解，还为乳腺癌的分子分型和靶向治疗提供了新思路。特别值得注意的是，PCAT18在不同乳腺癌亚型中可能发挥截然相反的作用，这种语境依赖性功能提示其在精准医疗中的潜在价值。未来针对HER2阳性乳腺癌等特定亚型的深入研究，将有助于全面揭示该基因的复杂调控网络。