综述：细胞外囊泡作为甲状腺癌生物标志物的诊断和预后潜力：系统综述

《Journal of Molecular Medicine》：The diagnostic and prognostic potential of extracellular vesicles as biomarkers for thyroid cancer: a systematic review

本综述系统评估了细胞外囊泡（EVs）作为甲状腺癌（TC）液体活检生物标志物的巨大潜力。文章指出，尽管当前研究（尤其是针对miRNA和蛋白质）显示出高诊断准确性（例如某些miRNA组合的AUC>0.9），但领域内存在方法学异质性和报告标准不统一的问题。作者强调，未来的临床转化亟需标准化操作流程（遵循MISEV指南）和更大规模的前瞻性队列验证，以推动多中心临床试验的开展。

　　

引言

甲状腺癌（TC）是全球最常见的内分泌恶性肿瘤，其发病率在过去四十年中惊人地增长了313%，现已成为全球第七大常见癌症，在女性中更是高居第五位。甲状腺结节（TNs）在人群中十分普遍，通过高分辨率超声检查，其检出率在女性中可达约45%，男性中约为30%。然而，在这些结节中，仅有7-15%最终被证实为恶性。

目前，细针穿刺细胞学检查（FNAC）是评估甲状腺结节的关键手段，其对乳头状甲状腺癌（PTC）具有较高的敏感性和特异性。但FNAC存在局限性：高达16%的样本因细胞量不足而无法诊断，其中约8%实际上是癌性的；此外，约20-40%的结节即使在获得充足细胞样本后仍被归类为“意义不明确的细胞非典型病变”或“滤泡性肿瘤”（Bethesda III/IV类），这类结节涵盖了从良性增生性结节、滤泡性腺瘤（FA）到恶性滤泡性甲状腺癌（FTC）、PTC滤泡亚型（FV-PTC）以及低风险肿瘤（如具有乳头样核特征的非浸润性滤泡性甲状腺肿瘤，NIFTP）等一系列病变。为了排除恶性肿瘤，大多数滤泡性结节患者不得不接受诊断性手术，而这其中仅有不到30%的病例术后病理证实为癌症，导致了大量不必要的手术及其相关风险（如手术并发症和约30%患者需要终身甲状腺激素替代治疗）。

在预后方面，约20-50%的PTC患者会发生淋巴结转移（LNM），6-20%的FTC患者会发生远处转移，这与肿瘤复发、预后较差和总生存期缩短密切相关。此外，甲状腺癌治疗后的复发监测也是一大临床挑战。目前，血清甲状腺球蛋白（Tg）是分化型甲状腺癌（DTC）术后监测的标准生物标志物，但其敏感性在仅行腺叶切除术的患者中显著降低，且约25%的患者存在抗Tg抗体，会干扰检测结果。

上述金标准检查手段的局限性凸显了对新型生物标志物的迫切需求，以期改善甲状腺癌的诊断、预后判断、术前分期和术后监测。液体活检作为一种非侵入性技术，通过分析体液中的肿瘤衍生组分，展现出巨大应用前景。其中，细胞外囊泡（EVs）因其独特的优势而备受关注。

EVs是由细胞释放的纳米级磷脂双分子层囊泡，携带来源细胞的蛋白质、RNA、DNA等生物活性分子，在细胞间通信中扮演重要角色。它们几乎存在于所有体液中，且其内容物受到膜结构的保护，稳定性高。相较于循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA等其他液体活检组分，EVs在分化型甲状腺癌患者中的丰度通常更高。因此，EVs被认为是极具潜力的癌症生物标志物来源。

方法论

本系统综述严格遵循PRISMA 2020指南，并已在PROSPERO注册。研究人员系统检索了Web of Science、Ovid Medline、Ovid Embase、Scopus和Emcare等数据库，时间从建库至2025年3月31日，语种限定为英文。检索策略结合了关键词和主题词。研究筛选和数据提取由两名研究人员独立完成。最终共有40项研究符合纳入标准。

纳入研究的质量使用诊断准确性研究质量评估工具（QUADAS-2）进行评估。数据提取内容包括第一作者、发表年份、国家、甲状腺癌类型、生物流体来源、EV分离方法、EV亚型、EV表征方法、EV生物标志物以及诊断准确性指标等。

结果

纳入研究概况

从2014年到2024年，该领域的研究呈现爆发式增长，77%的研究发表于2020年至2024年间。根据通讯作者单位，72%的研究来自亚洲，其中中国独占64%，没有研究来自非洲。

EV生物标志物类型

在研究的EV生物标志物中，EV RNA是最主要的研究对象，占74%（29/40），其中微小RNA（miRNA）占绝对主导（23/29），其次是环状RNA（circRNA）（4/29）、长链非编码RNA（lncRNA）（1/29）和信使RNA（mRNA）（1/29）。此外，有8项研究关注EV蛋白质，1项研究EV DNA，1项研究EV膜表面的促凝磷脂，还有1项应用表面增强拉曼光谱（SERS）分析EV的生化特征。值得注意的是，尚无研究探索EV脂质或代谢物作为甲状腺癌生物标志物。

研究焦点与样本来源

绝大多数研究（34/40）聚焦于乳头状甲状腺癌（PTC），仅有两项研究专门针对滤泡状甲状腺癌（FTC），一项研究同时包含两者。用于分离EV的生物流体主要是血浆（18/40）和血清（14/40），少数研究使用了尿液（3/40）或FNAC冲洗液等特殊来源。仅有7项研究对同一患者进行了术前和术后的配对样本分析。

EV分离与表征方法

EV分离方法多样，最常用的是EV沉淀试剂盒（17/40）和超速离心法（12/40）。其他方法包括差速离心、尺寸排阻色谱（SEC）、密度梯度离心以及免疫亲和捕获法（如利用甲状腺过氧化物酶TPO或肿瘤标志物B7H3/CD276、MUC1、EpCAM进行富集）。

在EV表征方面，大多数研究（30/40）使用了至少两种方法来确认分离物中EV的存在，但没有任何一项研究完全满足MISEV2018指南建议的所有四项表征参数（EV来源定量、EV浓度、通用EV标志物检测、非EV污染物评估）。纳米颗粒跟踪分析（NTA）和蛋白质印迹（检测CD63、CD81、CD9、TSG101等标志物）是最常用的技术。只有少数研究评估了共同分离的污染物（如钙联蛋白、载脂蛋白）。没有研究对EV纯度进行定量估计。

EV miRNA的诊断与预后潜力

诊断潜力：

多项研究表明，EV miRNA能有效区分PTC患者与健康对照（HC）或良性甲状腺结节患者。例如，与健康对照相比，PTC患者血清/血浆EV中miR-223-5p、miR-146b-5p、miR-21-5p等表达上调，而miR-29a、miR-181a-5p等表达下调。一些miRNA组合显示出极高的诊断效能，如miR-146b-5p、miR-223-5p和miR-182-5p组合区分PTC与健康对照的AUC可达0.981。在区分PTC与良性结节方面，miR-346、miR-10a-5p和miR-34a-5p组合也表现出色（AUC=0.887）。

对于滤泡性肿瘤的良恶性鉴别，尤其是针对意义不明确的滤泡性结节，EV miRNA也展现出潜力。有研究报道，从TPO阳性EV中检测到的Let-7家族miRNA（如Let-7f, Let-7g）在FTC患者中显著高表达，其AUC值在0.765至0.814之间。另一项针对滤泡性结节的研究则发现，恶性（FV-PTC和FTC）与非恶性（增生、FA、NIFTP）结节患者的血浆大细胞外囊泡（L-EVs）在miRNA（如miR-195-3p上调）和蛋白质（如KLK11、A1AG2上调，CXCL7下调）组学上存在差异。

预后潜力：

EV miRNA的表达水平与甲状腺癌的多种侵袭性特征相关。例如，miR-6774-3p和miR-6879-5p在伴有淋巴结转移（LNM）的PTC患者中上调，两者组合预测LNM的AUC高达0.914。EV miR-1296-5p的表达水平在放射性碘难治性（RAIR）PTC患者中显著升高，是RAIR的独立风险因素（AUC=0.911）。低水平的EV miR-29a与更大的肿瘤尺寸、甲状腺外侵犯、晚期TNM分期、更高的复发风险以及更短的无复发生存期和总生存期独立相关。在FTC中，一个包含5个miRNA（miR-127-3p, miR-223-5p, miR-432-5p, miR-146a-5p, miR-151a-3p）的组合与肿瘤负荷增加、血管侵犯、远处转移和晚期疾病显著相关。

术后监测：

部分研究追踪了患者术前术后EV miRNA的动态变化。例如，miR-126-3p、miR-145-5p、miR-31-5p、miRNA-21-5p等在PTC术后显著下降，而miR-29a在术后则逐渐升高。在FTC患者中，上述5-miRNA组合的水平在甲状腺切除术后及后续放射性碘治疗后显著下降，提示这些EV miRNA很可能直接来源于甲状腺癌组织本身。

其他EV生物标志物

• ??
  EV circRNA： 如circ_007293、circ_0082002和circ_0003863在PTC患者中上调，且与淋巴结转移、血管侵犯等不良预后特征相关，显示出作为诊断和预后标志物的潜力。其环状结构使其在EV中异常稳定。
• ??
  EV蛋白质： 研究发现，PTC患者EV中热休克蛋白（Hsp27, Hsp60, Hsp90）、免疫检查点蛋白（PD-1/PD-L1）等的水平升高，并与肿瘤大小、淋巴结转移相关。术后这些蛋白水平下降。蛋白质组学分析揭示了PTC，甚至是微小癌（PTMC）伴淋巴结转移患者EV中独特的蛋白质谱，例如BST2（CD317）的上调。
• ??
  EV mRNA/lncRNA： 有研究通过免疫亲和捕获肿瘤来源EV（表达B7H3、MUC1或EpCAM），并检测其携带的β-肌动蛋白（β-actin）mRNA，成功区分DTC患者与健康对照。
• ??
  EV DNA： 利用新型生物传感器从FNAC来源的EV中检测BRAF V600E突变DNA，有望预测PTC的淋巴结转移状态。
• ??
  EV物理与功能特性： 表面增强拉曼光谱（SERS）结合深度学习能通过EV的生化“指纹”高精度区分甲状腺癌患者和健康对照，甚至不同淋巴结转移分期。另有研究通过检测EV膜表面的促凝磷脂（如使用XACT assay），发现其水平在伴有LNM的TC患者中升高，提示其作为一种简单的自动化检测潜力。

讨论与展望

本系统综述全面评估了EVs作为甲状腺癌诊断、预后和监测生物标志物的巨大潜力。尽管现有结果令人鼓舞，特别是EV miRNA和蛋白质显示出高诊断准确性，但该领域仍面临挑战。

首要挑战是研究间存在高度的异质性，尤其是在EV的分离、表征方法以及qRT-PCR数据归一化参考基因的选择上缺乏统一标准。这导致了研究结果的可比性和可重复性降低。大多数研究为病例对照设计，存在固有的选择偏倚风险，且方法学细节报告不完整。

其次，大多数研究检测的是体液总EV池，而非特异地来源于甲状腺肿瘤的EV。虽然基于“肿瘤指纹”的策略已显示出价值，但未来通过免疫亲和捕获等技术富集组织或肿瘤特异性EV亚群，可能进一步提高诊断的特异性和灵敏度。

此外，当前研究主要集中在PTC上，对FTC、甲状腺髓样癌、未分化癌以及其他甲状腺结节的诊断困境（如意义不明确的滤泡性结节）的关注相对不足。EVs在预测酪氨酸激酶抑制剂治疗反应等方面的潜力也有待探索。

为了推动EV生物标志物的临床转化，未来的研究应着力于：

1. 1.1.
   标准化与规范化： 严格遵循MISEV2023等国际指南，规范EV研究流程，提高方法的可重复性。鼓励使用MIBlood-EV、MIFlowCyt-EV等清单报告实验细节，并将方案提交至EV-TRACK知识库。
2. 2.2.
   大规模前瞻性验证： 需要在包含所有相关鉴别诊断的大型、多中心、前瞻性队列中验证已识别出的候选生物标志物。
3. 3.3.
   探索临床应用场景： 针对甲状腺癌管理中的具体临床难题（如指导手术范围、避免过度治疗、识别高危亚型、监测复发等）开发相应的EV生物标志物面板。
4. 4.4.
   技术创新： 开发更高效、高灵敏度的EV分离与检测技术，如微流控平台，以满足未来临床应用的需求。

结论

细胞外囊泡（EVs）作为甲状腺癌液体活检的生物标志物来源，展现出巨大的诊断、预后和监测潜力。其内蕴藏的丰富分子信息（尤其是miRNA和蛋白质）以及自身的稳定性，为其临床应用奠定了坚实基础。然而，要实现从实验室到临床的跨越，必须解决当前存在的方